[發明專利]一種NAD+

有效

• 申請號: 202010151112.2
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111321133B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 馬耀宏;鄭嵐;馬恒;孟慶軍;王丙蓮;楊俊慧;楊艷;高廣恒
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生物研究所
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N9/04;C12P7/58
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

1.一種生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

將NAD⁺-瓊脂糖復合物加入戊二醛溶液中，然后向其中加入葡萄糖脫氫酶和乳酸脫氫酶進行反應，NAD⁺-葡萄糖脫氫酶-乳酸脫氫酶固定于瓊脂糖上，形成三酶復合體系，利用該三酶復合體系生產葡萄糖酸；

其中，所述NAD⁺-瓊脂糖復合物由改性NAD⁺與改性瓊脂糖凝膠復合得到；

所述改性NAD⁺具體為c6-羧甲基NAD⁺；

所述改性瓊脂糖凝膠具體采用環氧氯丙烷法活化瓊脂糖凝膠制備得到；

具體的，所述NAD⁺-瓊脂糖復合物，其制備方法包括：改性NAD⁺的制備；

改性瓊脂糖凝膠的制備；

向改性NAD⁺中加入偶聯劑后再加入改性瓊脂糖凝膠即得；

所述向改性NAD⁺中加入偶聯劑后再加入改性瓊脂糖凝膠的步驟具體方法為：調整c6-羧甲基NAD⁺水溶液pH至中性，加入偶聯劑后進行反應，然后再加入改性活化后的瓊脂糖凝膠加熱進行交聯反應；

所述偶聯劑為EDC與NHS的混合物。

2.如權利要求1所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，

戊二醛質量分數為2-3％，浸泡時間為20-60min，所述NAD+-瓊脂糖復合物與葡萄糖脫氫酶和乳酸脫氫酶的質量酶活比為1g:10-15U:120-180U。

3.如權利要求2所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，戊二醛質量分數為2.5％，浸泡時間為30min；所述NAD+-瓊脂糖復合物與葡萄糖脫氫酶和乳酸脫氫酶的質量酶活比為1g:12U:150U。

4.如權利要求1所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，改性NAD⁺的制備方法具體為：

1)向NAD⁺水溶液中加入環氧氯丙烷加熱得n1-羧甲基-NAD⁺；

2)在n1-羧甲基-NAD⁺水溶液中加入硫代硫酸鈉溶液，調節pH至堿性加熱得到n1-羧甲基-NADH，同時強堿條件下發生Dimroth重排得到n6-羧甲基NADH；

3)加入甲醛加熱反應，得c6-羧甲基NAD⁺。

5.如權利要求4所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，

所述步驟1)中，加熱反應為水浴加熱，水浴反應條件為在60～80℃條件下反應0.5～3h；

所述步驟2)中，pH調節至強堿性，加熱反應為水浴加熱；

所述步驟3)中，加熱反應為水浴加熱。

6.如權利要求5所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，

所述步驟1)中，水浴反應條件為70℃水浴反應1h；

所述步驟2)中，pH調節為10-11，水浴反應條件為在60～80℃條件下反應0.5～3h；

所述步驟3)中，水浴反應條件為在60～80℃條件下反應0.5～3h。

7.如權利要求6所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，

所述步驟2)中，水浴反應條件為70℃水浴反應1h；

所述步驟3)中，水浴反應條件為70℃水浴反應1h。

8.如權利要求1所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，

改性瓊脂糖凝膠的制備方法具體為：

向瓊脂糖凝膠中加入環氧氯丙烷后加入堿液在室溫下反應即得。

9.如權利要求8所述的生產葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠質量分數控制為0.5～2％，所述堿液為NaOH，所述反應具體條件為：在室溫下反應1～10h。