[發(fā)明專利]一種SARS-CoV-2的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010150878.9
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111321249A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 汪運山;楊煒華;釗倩倩;周云英;徐祎慧;王敏;王軍;韓淑毅
• 申請（專利權）人: 濟南市中心醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

本發(fā)明提供一種SARS?CoV?2的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、試劑盒及方法，屬于醫(yī)學分子生物學診斷技術領域。本發(fā)明基于RdRp、E和N基因在SARS?COV?2中穩(wěn)定性與獨特性，設計三組引物組對上述基因進行擴增檢測，降低引物濃度，提高了反應的特異性，降低假陽性；因此本發(fā)明提供的是一種檢測速度快、靈敏度高、特異性強的檢測引物組、試劑盒及檢測方法，具有良好的實際應用之價值。

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學診斷技術領域，具體涉及一種SARS-CoV-2的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

冠狀病毒是一個大型病毒家族，已知可引起感冒以及中東呼吸綜合征(MERS)和嚴重急性呼吸綜合征(SARS)等較嚴重疾病。SARS-COV-2是以前從未在人體中發(fā)現的冠狀病毒新毒株，其基因序列與SARS冠狀病毒有79.5％的相似性，進入細胞的路徑與SARS冠狀病毒相同，即通過ACE2細胞受體，但 SARS-COV-2比引發(fā)非典的SARS更容易傳播。

目前，臨床和疾控系統通過熒光PCR法檢測SARS-COV-2核酸或病毒核酸測序確證病毒感染。熒光PCR法需要特殊核酸擴增儀和檢測儀，而且擴增時使用兩條引物，靶向兩個基因片段，準確性有限，存在假陽性或假陰性。而且因靈敏度所限，出現多例患者核酸檢測陰性的現象，不僅使患者得不到及時診治，而且因漏診導致病毒進一步擴散感染，不利于疫情控制。新型冠狀病毒 (SARS-COV-2)感染引起的肺炎疫情需要更加準確、快速、便捷的檢測方法和檢測試劑。環(huán)介導等溫擴增方法(LAMP)是近幾年新興的一種基因擴增方法，采用4-6條引物，靶向6條或更多基因片段，特異性強，而且擴增效率特別高，使得擴增產物肉眼可見，對儀器設備、操作人員和場地要求不高，與常見的核酸擴增技術相比較，它具有以下幾個明顯的優(yōu)勢:1)整個擴增過程在恒溫下完成，不需要復雜的變溫設備；2)擴增效率更高，是一般PCR擴增效率的10-100倍； 3)耗時更少，一般PCR擴增需要花費2-3h，而LAMP擴增只需要0.5-1h即可完成；4)結果可目視，容易判斷，無需電泳或熒光檢測儀，節(jié)約時間，避免污染。LAMP的這些優(yōu)勢使得其自發(fā)明以來就獲得廣泛關注，但發(fā)明人發(fā)現，在醫(yī)療領域目前只有檢測結核分枝桿菌、沙門氏菌和軍團菌的試劑盒商品化，尚未有SARS-COV-2的方法及試劑盒的相關報道。

發(fā)明內容

針對上述現有技術的不足，本發(fā)明基于RdRp、E和N基因在SARS-COV-2 中穩(wěn)定性與獨特性，提供了一種檢測速度快、靈敏度高、特異性檢測SARS-COV-2 的LAMP檢測用引物組、試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明的目的之一在于提供一種SARS-CoV-2的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組，所述LAMP檢測引物組至少包括第一引物組、第二引物組和第三引物組；其中，第一引物組核苷酸序列如下：

F3:5'-GTTACGATGGTGGCTGTA-3'(SEQ ID NO.1)；

B3:5'-GGCATACTTAAGATTCATTTGAG-3'(SEQ ID NO.2)；

FIP:

5'-AGCCTTACCCCATTTATTAAATGGAGCTAACCAAGTCATCGTCAA-3'(SEQ ID NO.3)；

BIP:5'- AATGAGTTATGAGGATCAAGATGCATTATAGTAGGGATGACATTACGT -3'(SEQ IDNO.4)；

Lp:5'-AAACCAGCTGATTTGTCTAGGTTG-3'(SEQ ID NO.5)。

第二引物組核苷酸序列如下：