[發明專利]基于雙熒光探針的多重數字PCR的核酸定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010148909.7
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111218501A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 陳芊如;王芳;王楠;祝令香;郭永;楊文軍
• 申請（專利權）人: 新羿制造科技（北京）有限公司;清華大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供基于雙熒光探針的多重數字PCR的核酸定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測第一靶標的第一探針、檢測第二靶標的第二探針和檢測第三靶標的第三探針；第一探針用第一熒光基團標記，第二探針用第二熒光基團標記，第三探針一部分用第一熒光基團標記，另一部分用第二熒光基團標記，第一熒光基團和第二熒光基團是兩種不同的熒光基團；和基于三種靶標多重數字PCR得到的二維結果圖，實現對待測三種靶標的分別定量。基于目前的雙熒光通道檢測系統，開發雙熒光探針多重數字PCR方法意義重大，使得數字PCR技術更符合臨床需求、應用更廣泛。

技術領域

本發明涉及數字PCR技術領域，具體涉及基于雙熒光探針的多重數字 PCR的核酸定量檢測試劑盒。

背景技術

數字PCR是一種核酸定量技術，其基本原理是將核酸稀釋并平均分配到無數個獨立的反應單元中，對反應單元中的PCR體系進行PCR擴增，然后通過PCR終點信號“有或無”來實現不依賴于標準曲線的單分子絕對定量。數字PCR具有高靈敏度、絕對定量、抗干擾性強的優勢，因此越來越廣泛的應用在醫療保健、生物研究等諸多領域。

目前大部分的數字PCR系統為雙熒光通道檢測系統，即能夠同時檢測反應單元中發出的兩種熒光信號，因此最多只能同時定量兩個靶標，每個靶標對應的檢測探針標記不同的熒光基團。然而，在實際應用中需要定量的靶標數量往往多于兩個。例如在病原體檢測中，患者感染的病原體的可能性就有數十種，需要對數十種靶標進行定量，準確找出患者感染的病原體以給出最優治療方案；在遺傳性耳聾突變檢測中，熱點突變位點有數十個，因此需要篩查數十個突變位點以確認耳聾的患病情況。因此，在一次反應中檢測多靶標的多重數字PCR具有很大的需求。

發明內容

本發明基于上述需求，提供了基于雙熒光探針的多重數字PCR的核酸定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測第一靶標的第一探針、檢測第二靶標的第二探針和檢測第三靶標的第三探針，第一、第二和第三靶標是不同的靶標，相應地第一探針、第二探針和第三探針是不同的探針；第一探針用第一熒光基團標記，第二探針用第二熒光基團標記，第三探針一部分用第一熒光基團標記，另一部分用第二熒光基團標記，第一熒光基團和第二熒光基團是兩種不同的熒光基團；和基于三種靶標多重數字PCR得到的二維結果圖，實現對待測三種靶標的分別定量。

在一種實施方式中，所述試劑盒還包括分別用于擴增三種不同靶標的三對引物。

在一種實施方式中，所述第三探針用第一熒光基團標記和第二熒光基團標記的比例是1:3-3:1。

在一種實施方式中，所述第三探針用第一熒光基團標記和第二熒光基團標記的比例是1:1。

在一種實施方式中，所述第一熒光基團和所述第二熒光基團是分別選自 FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TED、NED、Cy5和Cy5.5中的任一種。

在一種實施方式中，所述試劑盒是用于檢測新型冠狀病毒的試劑盒，所述試劑盒包括以下引物和探針：

在一種實施方式中，所述試劑盒是用于人HER2基因定量的數字PCR 試劑盒，所述試劑盒包括以下引物和探針：

在本發明中三種靶標用總共兩種標記的三條探針檢測，其中一個靶標用兩種不同熒光標記的探針進行檢測，另外二個靶標分別用一種熒光標記的探針進行檢測，以將三種靶標的數字PCR擴增信號在二維散點圖上位置區分開來。通過二維散點圖上三種靶標檢測的不同情況，確認三個靶標不同的擴增情況。

多靶標同時檢測能夠減少樣本用量、縮短檢測時間、節省試劑材料、增加檢測通量和降低成本。基于目前的雙熒光通道檢測系統，開發雙熒光探針多重數字PCR方法意義重大，使得數字PCR技術更符合臨床需求、應用更廣泛。

附圖說明