[發明專利]小金蝠蛾的實時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針

有效

• 申請號: 202010148471.2
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111057773B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 劉靜遠;朱雅君;傅怡寧
• 申請（專利權）人: 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

本發明公開了一種冬蟲夏草寄主昆蟲小金蝠蛾的實時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針，根據小金蝠蛾的mtDNA中部分基因的序列設計特異性引物XJF2/XJR2和探針PC?MGB2，建立了小金蝠蛾的實時熒光PCR檢測方法，以達到快速準確檢測鑒定小金蝠蛾，并用于在多種冬蟲夏草寄主昆蟲中準確區分小金蝠蛾的目的。

技術領域

本發明涉及中藥材和植物檢疫技術領域，具體涉及一種小金蝠蛾的實時熒光PCR檢測方法；此外，本發明還涉及檢測小金蝠蛾的引物和探針。

背景技術

小金蝠蛾Hepialus xiaojincusis，隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科（Hepialidae）蝠蛾屬（Hepialus），是四川省小金縣的冬蟲夏草寄主昆蟲，冬蟲夏草是我國名貴的中藥材，被稱為“中藥三寶”之一，在我國僅在青藏高原的西藏、青海、四川、云南、甘肅五省部分地區有分布。同時，冬蟲夏草寄主昆蟲具有種類的狹域分布、垂直分布特征，通常一個產區的冬蟲夏草寄主昆蟲為一種昆蟲，在中藥材領域，不同地區的冬蟲夏草品級相差較大。因此，區分冬蟲夏草的產區，能有效的區分冬蟲夏草的品級，因此建立不同產地冬蟲夏草的快速準確鑒定方法十分必要。

冬蟲夏草的品級根據寄主昆蟲的產地、大小及顏色進行區分，而冬蟲夏草的形態學觀察不能確定其產地，影響鑒定準確率，進而影響冬蟲夏草的正確評級。

中國發明專利申請CN201210506713公開了一種冬蟲夏草原草粉的雙重PCR鑒真方法，其運用冬蟲夏草菌和冬蟲夏草寄主昆蟲通用引物進行雙重PCR擴增的鑒別冬蟲夏草原粉，與本專利申請目標和方法不同，無法進行冬蟲夏草寄主昆蟲檢測。

中國發明專利申請CN201711340871公開了冬蟲夏草菌培養液中蝙蝠蛾擬青霉的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法，其通過常規PCR反應檢測冬蟲夏草菌培養液中蝙蝠蛾擬青霉的攜帶情況的方法，用于檢測冬蟲夏草菌培養液，與本專利申請目標和方法不同。

中國發明專利申請CN201210034612公開了一種鑒別冬蟲夏草的線粒體基因序列和方法，通過設計冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾科特異性引物以區別冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾科與其它鱗翅目昆蟲，用于鑒別冬蟲夏草真偽，根據最新冬蟲夏草寄主昆蟲研究進展，冬蟲夏草寄主昆蟲分類地位變化，冬蟲夏草寄主昆蟲主要集中在蝙蝠蛾科現鉤蝠蛾屬(Thitarodes)、無鉤蝠蛾屬( Ahamus) 和蝠蛾屬( Hepialus)(鄒志文等,2010;邱乙等,2015)。該專利中將是否為蝙蝠蛾科昆蟲作為鑒定冬蟲夏草真偽的標準已不符合實際情況。另外，其目標與方法與本專利申請不同。

中國發明專利申請CN201910910660公開了熒光定量PCR檢測粉擬青霉菌的引物和探針，其針對人工培育冬蟲夏草夏草過程中出現的寄主昆蟲致死菌-粉擬青霉菌的實時熒光檢測方法，檢測目標與本專利申請檢測目標不同。

目前沒有四川省小金縣冬蟲夏草寄主昆蟲小金蝠蛾的實時熒光鑒定相關的專利文獻和非專利文獻公開。

本發明針對名貴中藥冬蟲夏草的寄主昆蟲進行鑒定區分。中藥材冬蟲夏草為冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae昆蟲幼蟲上以后形成的僵蟲和菌子實體的干燥體，無法在形態上區分冬蟲夏草的寄主昆蟲，且冬蟲夏草寄主昆蟲種類繁多，地理分布較近的種類分子水平的差異也較小，這對實時熒光特異性Taqman探針的設計造成一定難度，是本領域的技術難題。因此，本領域亟需解決這一技術難題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種小金蝠蛾的實時熒光PCR檢測方法；為此，本發明還提供用于上述方法的檢測引物和探針。利用小金蝠蛾檢測引物及探針可以快速、準確地對四川省小金縣產的冬蟲夏草進行檢測鑒定。

本發明根據小金蝠蛾的mtDNA中部分基因的序列設計特異性引物和探針，建立了小金蝠蛾的實時熒光PCR 檢測方法，以達到快速準確檢測鑒定小金蝠蛾的目的。