[發明專利]一種小鼠心外膜細胞分離培養方法

在審

• 申請號: 202010145485.9
• 申請日: 2020-03-05
• 公開（公告）號: CN111321112A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 馬曉欣;陸海霞;王用利
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

本發明公開了一種小鼠心外膜細胞分離培養方法，包括如下步驟：將離體小鼠心臟放置于無菌離心管I中，加入混合消化液，在37℃進行震蕩消化，靜置，后將消化后含有懸浮細胞的上清液轉移至離心管II中；所述離心管II的環境溫度為0℃以下；重復上述消化步驟以消化小鼠心臟，后加入胎牛血清中止消化；將收集在離心管II內的所有含有懸浮細胞的上清液進行過濾、離心；離心后，去除上清液，加入含胎牛血清的培養液，混懸沉淀細胞，流式分選，然后將細胞均勻接種于涂有明膠的培養皿中，置于培養箱中培養，即可培養得到小鼠心外膜細胞。本發明利用心肌梗死后心外膜活化，EPDCs重新表達WT1的原理，從轉基因小鼠中分離和培養EPDCs。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種小鼠心外膜細胞分離培養方法。

背景技術

干細胞移植一直是心肌再生領域的研究熱點。大量的基礎研究和臨床試驗證實干細胞移植能夠在一定程度上修復梗死心肌。然而，受到局部不利微環境等多種因素的影響，干細胞移植面臨著存活和分化效率低等瓶頸問題。近來，內源性心肌修復已引起人們的廣泛關注，為心肌梗死的治療開辟了新的途徑。通過調動自身的內源性心肌再生機制，不僅可以補充受損的心肌細胞，也可避免因細胞移植帶來的副作用，故此策略在心肌修復方面具備獨特的優勢。

心外膜作為心臟的重要組成部分之一，其在內源性心肌修復中的作用已引起人們的極大興趣。在心臟發育過程中，部分心外膜細胞活化，發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)形成具有多向分化潛能的心外膜源性細胞(epicardium-derived cells,EPDCs)。EPDCs遷入心肌層參與心臟的發生和冠狀血管的形成。此外，心外膜對心肌細胞的成熟、增殖和心室致密層的形成也起到重要調節作用。最新研究發現，心肌損傷后心外膜能夠再次被活化，心外膜細胞經EMT形成EPDCs。斑馬魚心臟損傷后，通過EMT形成的EPDCs能夠遷移至損傷部位完全修復受損心肌。與斑馬魚相比，哺乳動物新形成的EPDCs失去了胚胎期向心肌層遷移和分化為心肌細胞的能力，但可以通過旁分泌作用刺激血管新生和心肌再生。此外，快速增殖的心外膜細胞遷移覆蓋到梗死區表面，分化為成纖維細胞并分泌多種細胞外基質，從而對梗死的心室壁起到初期的支撐作用，以防止心室進一步擴張。鑒于心外膜在哺乳動物心臟發育和在斑馬魚心肌再生中的關鍵作用，分離和培養EPDCs，并深入探索激活成年哺乳動物心外膜和促進內源性心肌再生的有效措施具有重要應用意義。

因此，亟需提供一種小鼠心外膜細胞分離培養方法，以解決傳統植塊法體外細胞培養存在純度較低及效率低下問題。心外膜在哺乳動物心臟發育起關鍵作用，分離和培養心外膜細胞(EPDCs)，并深入探索激活成年哺乳動物心外膜和促進內源性心肌再生的有效措施具有重要應用意義。

發明內容

本發明的目的在于克服傳統植塊法體外細胞培養的缺點，提供一種小鼠心外膜細胞分離培養方法，提高心外膜細胞分離及培養的純度及效率。

為了實現上述目的，本發明提供了一種小鼠心外膜細胞分離培養方法，包括如下步驟：

S1、將離體小鼠心臟放置于無菌離心管I中，加入混合消化液，并在37℃條件下進行震蕩消化，靜置，后將消化后含有懸浮細胞的上清液轉移至離心管II中；所述離心管II的環境溫度為0℃以下；

S2、重復上述消化步驟7～8次，以消化小鼠心臟，后加入胎牛血清中止消化；將收集在離心管II內的所有含有懸浮細胞的上清液進行過濾、離心；

S3、離心后，去除上清液，加入含15％胎牛血清的培養液，混懸沉淀細胞，進行流式分選得到純度較高的心外膜細胞，然后將細胞均勻接種于涂有明膠的培養皿中，置于培養箱中培養，即可；

其中，所述小鼠采用轉基因小鼠，為誘導性的特異性重組酶熒光小鼠。

進一步，所述混合消化液包括0.05％胰蛋白酶和0.08％IV型膠原蛋白酶。