[發明專利]一種臍帶組織非冷凍保存方法

在審

• 申請號: 202010145155.X
• 申請日: 2020-02-27
• 公開（公告）號: CN113303323A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 王麗莎;李治寰;林立龍
• 申請（專利權）人: 東莞市恩聯干細胞生物科技研究院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種臍帶組織非冷凍保存方法。主要步驟為將臍帶組織剪成4?5cm小段，去除血液洗凈后放入50mL離心管中，加入10％血替完全培養基(培養基量以沒過組織為準)，用封口膜封好后至于4℃保存。保存5?10天分離制備后可以得到的原代細胞數量可以達到新鮮組織分離制備細胞的90％以上，而且細胞活率和新鮮組織無異。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種臍帶組織非冷凍保存方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一類具有自我更新和分化能力的細胞。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。臍帶間充質干細胞來源于臍帶華通氏膠，能夠分化為多種組織細胞，且在傳代12代以后仍具有較強的分化能力，低代次可以作為種子細胞儲存，高代次細胞可以用于臨床試驗。臍帶間充質干細胞還具有免疫源性低，使用無需配型，對采集者無副作用，獲得細胞數量多等特點，是臨床細胞治療的重要材料。

臍帶間充質干細胞擁有眾多優點，但是采集、分離、制備過程步驟多，耗時長，容易被細菌真菌支原體污染。為了避免污染，研究者通?？紤]使用抗生素，但是這樣獲得的細胞可能會有抗生素殘留的風險，不利于臨床使用。另外，一些臨床應用及科研實驗需要新鮮組織為原材料，但因為各種原因采集到的臍帶組織沒有辦法被及時處理而只能遭丟棄。為了解決這些問題，我們發明了一種臍帶組織的保存方法，這種方法能夠使臍帶組織保存五天之后達到和新鮮臍帶組織同樣的效果，利用這種方法可以有效的保存臍帶組織。

發明內容

為了解決以上問題，我們發明了一種臍帶組織低溫保存方法，采用含0-10％血清替代物的基礎培養基低溫保存臍帶組織。使用這種方法保存組織5-15天后，仍然可以從組織中獲得較多細胞數量，并且細胞質量也較好。

本發明所采用的保存液為含血替的基礎培養基，優選地含10％血替的基礎培養基保存組織效果更好，優選地血替采用血小板裂解液效果更好。

本發明所采用的低溫保存條件為2-8℃，優選地4℃保存條件更佳；保存時間為5-15天，優選地保存5天效果更好。

本發明的優點：避免使用抗生素，生產的臍帶間充質干細胞滿足臨床細胞制備的要求；保存時間長，滿足科研和臨床實踐中臍帶組織暫時保存的需要；另外操作簡單，無需冷凍，是保存組織的好方法。

附圖說明

圖1含10％血替的基礎培養基保存5天的臍帶組織培養的原代細胞

圖2含10％血替的基礎培養基保存5天的臍帶組織培養的P3代細胞表面抗原檢測結果

圖3含10％血替的基礎培養基保存5天的臍帶組織培養的P3代細胞成脂、成骨、成軟骨染色結果

具體實施方式

我們比較了四種保存液的保存方法，這四種保存液分別是生理鹽水、基礎培養基、含5％血替的完全培養基和含10％血替的完全培養基。所涉及的臍帶組織來源于志愿者捐贈。

準備四根臍帶，每一根臍帶采用一種保存方式。主要步驟包括以下內容

1、將新鮮臍帶組織用75％乙醇噴洗表面后立即用大量生理鹽水沖洗后，用手術剪剪掉臍帶兩端，用鑷子排盡血管內血液并清洗干凈后，用剪刀將臍帶組織剪為3cm長組織段(棄掉水腫部分)，將組織段平均分為四份，一份立即分離制備，剩下三份采用含10％血替的完全培養基的保存液保存于50mL離心管中，其他三根臍帶同樣分為四份，分別保存在生理鹽水、基礎培養基、含5％血替的完全培養基中，用封口膜封好置于4℃保存。每隔五天制備一份臍帶組織，每份接種3瓶T75培養瓶。