[發(fā)明專利]液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測納米材料表面脂多糖的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010144546.X
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111289642B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡曉明;于潔;夏凱華
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州金緯標(biāo)檢測有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測納米材料表面脂多糖的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法包括如下步驟：從納米材料表面提取細(xì)菌脂多糖，再用1％乙酸水解脂多糖，生成特異性水解產(chǎn)物3?脫氧?D?甘露?2?辛酮糖酸，液相色譜分離串聯(lián)質(zhì)譜檢測上述水解產(chǎn)物，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。本發(fā)明的方法具有較高的準(zhǔn)確度、精確度和靈敏度，并且穩(wěn)定性強，適用于準(zhǔn)確定量納米材料表面細(xì)菌脂多糖，可用于輔助納米材料安全性評價。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測納米材料表面脂多糖的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1-100nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。目前，多種多樣的納米材料，例如SiO₂，Ag，TiO₂等已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品添加劑，儲存材料，護膚品，醫(yī)療器械等。這一類產(chǎn)品通稱為納米產(chǎn)品，可以通過呼吸系統(tǒng)，胃腸道系統(tǒng)，皮膚接觸，血液接觸等方式暴露于人體，可能對人體造成潛在的危害。美國FDA在2018年頒布了納米技術(shù)指導(dǎo)文件，提出了納米產(chǎn)品的安全性檢測的指導(dǎo)原則(https://www.fda.gov/ScienceResearch/SpecialTopics/Nanotechnology/ucm602536.htm)。脂多糖是革蘭氏陰性菌的主要成分之一，在傳統(tǒng)概念中，又稱為內(nèi)毒素，在體內(nèi)可引起發(fā)熱、休克，甚至導(dǎo)致死亡。脂多糖是食品、護膚品、醫(yī)療產(chǎn)品等與人體密切接觸的工業(yè)產(chǎn)品安全性是否達標(biāo)的重要生物指標(biāo)。

目前，內(nèi)毒素檢測的國標(biāo)方法為鱟試劑法[GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法，第二部分：生物學(xué)試驗方法]，鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素。在傳統(tǒng)工業(yè)產(chǎn)品的安全性檢測中，該方法具有簡單、易操作、適合高通量檢測等優(yōu)點。然而，納米材料由于其高表面活性及類生物分子活性，鱟試劑法在檢測納米材料的內(nèi)毒素含量時往往存在假陽性的數(shù)據(jù)(Li et al,NANOTOXICOLOGY，2015，462-473)，影響對納米產(chǎn)品安全性的準(zhǔn)確評估。例如，氧化石墨烯納米材料具有類內(nèi)毒素的親和性能與細(xì)胞Toll樣受體結(jié)合(Qu et al,ACS Nano,2013，5732；Chen et al,ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS，2014，1486)。此外，盡管市場上還有酶聯(lián)免疫法，即利用試劑盒中的脂多糖抗體與脂多糖中的O-抗原反應(yīng)而實現(xiàn)對脂多糖進行檢測，但是由于脂多糖是胸腺非依賴性抗原(TI抗原)，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生高親和力的抗體，所以該方法存在特異性差，抗干擾能力弱等缺陷，也很難應(yīng)用于納米產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢測。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決納米材料內(nèi)毒素檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題，本發(fā)明提供一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測納米材料表面細(xì)菌脂多糖的方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測納米材料表面脂多糖的方法，包括如下步驟：

S1、采用酚水提取納米材料表面脂多糖得到脂多糖提取液；

S2、將脂多糖提取液進行酸水解處理得到含有3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸的檢測液；

S3、采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對檢測液進行檢測；

S4、以3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用外標(biāo)法進行脂多糖定量。

進一步地，S1步驟中，納米材料表面脂多糖提取具體是將0.01-100g納米材料，用水清洗后分散在1-90％的酚水中，在20-50℃超聲0.1-100h后，30-100℃加熱1-48h，冷卻后離心取上清液，下層酚相加0.1-100ml水，振搖0.5-50min，渦旋0.5-50min，離心后取上清液，合并上清液得到所述的脂多糖提取液。

進一步地，所述的超聲的功率為1-100W。