[發明專利]特異性識別牛妊娠相關糖蛋白4的核酸適配體及其應用

有效

• 申請號: 202010143889.4
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111500583B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 劉長彬;盧春霞
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68;G01N33/53
• 代理公司: 蘇州吳韻知識產權代理事務所(普通合伙) 32364
• 代理人: 王銘陸

本發明提供了一種特異性結合牛妊娠相關糖蛋白4的核酸適配體，所述核酸適配體序列包含SEQ ID No.1序列中任一種。本發明的核酸適配體還可以是各種同源性較高的類似序列或由本發明序列得到的衍生物。本發明還提供核酸適配體的應用。本發明的核酸適配體是通過磁珠?SELEX技術篩選得到，不僅能結合bPAG4靶標蛋白，還有選擇性結合bPAG同類蛋白，而與其他蛋白不發生特異性結合，可用于從復雜體系中捕獲bPAG蛋白，適用于bPAG蛋白的檢測、分離純化及牛早孕快速診斷。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種特異性識別牛妊娠相關糖蛋白4（bPAG4）的核酸適配體，尤其涉及該核酸適配體在妊娠相關糖蛋白（bPAG）檢測和家畜早期妊娠診斷中的應用。

背景技術

牛妊娠相關糖蛋白 ( bovine pregnancy-associated glycoproteins，bPAG) 屬于天冬氨酸蛋白酶家族，與胃蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E有50%以上的相同氨基酸序列。bPAG種類較多，至少包括22種bPAG蛋白，由胎盤滋養層細胞表達產生（Xie 等，1994；Hughes 等，2000），在胚胎附植后進入母體血液，在整個妊娠期的表達和分泌呈現時空特異性（Green 等，2000； Wooding 等，2005；Telugu 等；2009），常作為一種標志物用于家畜早期妊娠診斷（Zoli 等 1992；Friedrich 等，2010；Reese 等，2018）。

目前，基于免疫分析方法對血液或奶樣中PAG的檢測，已成為國際上應用最廣泛的早期妊娠檢測方法（Dufour 等，2017；Kaya 等，2016；Commun 等，2016）。可對授精后28d的家畜進行早期妊娠診斷，診斷準確率達到90%以上（年Ricci 等，2015；張春剛等人，2015；Karen 等，2015）。目前商品化的PAG檢測試劑盒已應用于生產，如美國愛德士（IDEXX）公司開發的基于酶聯免疫反應原理的牛快速可視檢測試劑盒，可檢測牛血清或EDTA血漿中的PAG，但國內市場上銷售的快速檢測試劑盒價格頗高，限制了在國內大規模推廣使用。因此，鑒于目前免疫分析方法中抗體制備周期長，成本高等問題，急需發展一種新型的識別分子，以克服抗體在制備和使用中的不足，將對家畜早孕檢測技術產生重大的意義。

近些年，核酸適配體（Aptamer）作為新型識別分子逐漸成為研究熱點，其本質是一段單鏈寡核苷酸折疊成發夾、莖環、假結體及G-四鏈體等二級或三級結構，通過氫鍵、范德華力等與靶分子相互作用而形成穩定的復合物，其空間結構的多樣性幾乎可以與所有種類的靶分子（細胞因子、蛋白、生物毒素、金屬離子、小分子物質、細胞、微生物等）發生結合。與傳統的抗體相比，具有適應范圍廣；高親和力和高特異性，不受免疫條件和免疫原性限制；制備簡單，可體外人工合成；變性與復性可逆，穩定性高；易于改造、標記和保存等優點。因此，核酸適配體作為一種理想的分子探針在分析檢測、疾病診斷及治療等領域得到廣泛應用。

目前，還未見到家畜妊娠相關糖蛋白核酸適配體的研究報道。

發明內容

要解決的技術問題：針對現有技術的不足，本發明提出了一種特異性結合bPAG4蛋白的核酸適配體及其應用，本發明對bPAG4蛋白具有高的結合能力，并且能選擇性識別bPAG蛋白家族成員。

技術方案：一種特異性識別牛妊娠相關糖蛋白4（bPAG4）的核酸適配體，所述核酸適配體序列包括SEQ IDNo .1所示的DNA序列構成，其中，SEQ IDNo .1所示的DNA序列為

5’-TTGAAGTGACTCCGCACTGGGTGGGTGGGAGGGTCGTGCGGCTGGTCATAGCAGGT-3’。

優選的，所述核酸適配體序列可被修飾，所述修飾包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巰基化或同位素化，條件是這樣修飾后得到的核酸適配體序列具有合乎需要的性質。