[發明專利]一種改進小鼠眼球冰凍切片的制作方法

有效

• 申請號: 202010143762.2
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111238901B
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 張侯斌
• 申請（專利權）人: 四川省人民醫院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36;G01N1/42
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 鄒仕娟

本發明公開了一種改進小鼠眼球冰凍切片的制作方法，通過將小鼠眼球在固定液中固定后，在鞏膜上涂抹一層膠水，可以防止在后續的操作過程中很好地避免眼球形變引起的視網膜與RPE層的脫離以及感光細胞外節與內節連接處的斷裂；待鞏膜表面的膠水凝固后，剪去角膜，取出晶體，放入裝有包埋液的包埋盒中，在－80℃條件下速凍，用冰凍切片機把組織切成適當厚度的切片。本發明方法可以提高改善冰凍切片中組織形態。

技術領域

本發明屬于生物顯微組織切片技術領域，具體涉及一種改進小鼠眼球冰凍切片的制作方法。

背景技術

視網膜的疾病研究一般利用小鼠模型用于模擬人的疾病，通過對小鼠模型的研究來揭示視網膜的致病機制。在研究的過程中，需要用免疫組化或者是免疫熒光染色的方法探究小鼠眼球或者視網膜的病理情況。免疫組化和免疫熒光染色一般是用抗體檢測眼球組織切片中蛋白或其他抗原分子的分布和表達情況。在各種眼球的組織切片中，冰凍切片是最適合用于免疫組化和免疫熒光染色的，因為冰凍切片能夠更好地保留組織中抗原的免疫反應性。

目前通用的小鼠眼球冰凍切片的基本自備流程是先把小鼠眼球摘出來，用多聚甲醛固定一定時間后，用蔗糖溶液脫水，剪去角膜組織，取出晶體，把剩下的眼杯組織用包埋液(一般是用OCT)包埋，冷凍固化后，用冰凍切片機切成薄片。

由于小鼠的眼球比較脆弱，尤其是年輕小鼠的眼球，加上視網膜的特殊構造，在制作小鼠眼球冰凍切片的組織處理過程中，需要把小鼠的角膜在顯微鏡下剪掉角膜，然后取出晶體，在此過程中必然會牽扯眼球內的視網膜組織。在眼球內，視網膜組織與與單層的視網膜色素上皮層(RPE比較松散的接觸。因而，在組織處理中視網膜很容易從RPE上脫離下來，導致視網膜形態扭曲變性。另一方面，視網膜中感光細胞的外節(outer segment)和內節(inner segment)是由非常細小的連接纖毛相連接。連接纖毛很脆弱，也容易在組織處理中斷開，導致外節與內節分離。由于這些因素的存在，眼球組織的冰凍切片上往往會出現網脫或者空洞，嚴重影響免疫組化的結果。即使是非常有經驗的研究人員，也不能穩定地得到理想的結果。最終導致很多經過長周期努力培育出來的小鼠，因為不能得到好的免疫組化結果，浪費了寶貴的實驗材料和時間。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種改進小鼠眼球冰凍切片的制作方法，該方法可以提高改善冰凍切片中組織形態，防止眼球組織變形引起的網脫和感光細胞的斷裂。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種改進小鼠眼球冰凍切片的制作方法，包括以下步驟：

1)將小鼠眼球置于固定液中在冰溫條件下固定10min；

2)在小鼠眼球的角膜剪小口，置于固定液中在冰溫條件下固定2h；

3)洗去小鼠眼球上的固定液，在4℃條件下脫水過夜；

4)取出小鼠眼球，在鞏膜上涂抹一層膠水；

5)待鞏膜表面的膠水凝固后，剪去角膜，取出晶體；

6)將去除的角膜和晶體的眼杯放入裝有包埋液的包埋盒中，在－80℃條件下速凍；

7)用冰凍切片機把組織切成適當厚度的切片。

進一步的，步驟(1)所述的固定液為PBS緩沖液或多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液。優選的，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1M，多聚甲醛的質量濃度為4％。

進一步的，步驟(3)中脫水采用PBS配備的蔗糖溶液，蔗糖溶液的質量濃度為30％。

進一步的，步驟(4)所述的膠水為以α-氰基丙烯酸乙酯為主的膠水。

進一步的，步驟(6)中的包埋液為OCT。

本發明的有益效果為：