[發明專利]一種肝癌循環腫瘤細胞表型分析方法

在審

• 申請號: 202010143064.2
• 申請日: 2020-03-04
• 公開（公告）號: CN111443197A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 楊朝勇;朱琳;林慧彬;萬霜;陳小鋒;宋彥齡
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

本發明公開了一種肝癌循環腫瘤細胞表型分析方法，包括如下步驟，1)構建包括兩個處理單元的微流控芯片，其中，每個處理單元包括：由多個橫截面為三角形的微柱組成的微陣列、以及位于該三角形微陣列入口一側的兩個進樣口和位于該三角形微陣列出口一側的兩個出樣口；兩個處理單元分別修飾上皮細胞粘附分子EpCAM抗體和去唾液酸糖蛋白受體ASGPR抗體2)樣品分別從兩個處理單元的入口進入，并從出口流出；3)對兩個處理單元捕獲后的循環腫瘤細胞通過免疫染色法鑒定上皮表型與非上皮表型。本發明方法能夠提高肝癌循環腫瘤細胞的捕獲效率、純度和檢出率，并可對肝癌循環腫瘤細胞進行表型分析。

技術領域

本發明涉及一種肝癌循環腫瘤細胞表型分析方法。

背景技術

肝細胞癌的發病率在所有癌癥中位列世界第五，是癌癥相關死亡的第三大原因。肝細胞癌診斷的金標準為組織活檢，然而該方法存在取樣難、代表性不全、并發癥等風險。肝細胞癌早期篩查主要依賴影像學方法和血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)檢測。影像學方法較依賴操作者的主觀判斷，且靈敏度不夠。AFP檢測靈敏度和特異度分別僅有39–64％和76–91％，假陽性、假陰性率高。因此，迫切需要尋找準確度高、靈敏度高、無創的肝細胞癌診斷方法。

循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是指從腫瘤病灶脫落，進入血液循環的腫瘤細胞，是造成腫瘤擴散和轉移的重要原因。已有研究表明肝細胞癌循環腫瘤細胞與肝細胞的預后和惡性進展有關，因此檢測肝細胞癌CTC可用于肝細胞癌的早期診斷，復發轉移監測，療效評估等領域。目前基于親和法分離肝細胞癌CTC的方法主要依賴上皮細胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)識別，其中最經典的方法為CellSearch法，該方法是目前唯一通過美國FDA認證的CTC分離方法，該方法通過偶聯有EpCAM抗體的磁珠從全血中分離CTC。研究表明，肝細胞癌組織的EpCAM陽性率僅有20％-35％，因此通過單一上皮標志物的識別分離，勢必造成漏檢，難以提供有意義的臨床指導。CTC在循環系統中發生上皮間質轉換(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程將導致CTC的異質性。此過程將增加上皮細胞轉移和侵襲能力，伴有CTC上皮樣特性的消失和間質特征的獲得，在CTC從原發灶脫落進入血液循環系統并形成腫瘤轉移灶的過程中發揮重要作用，與腫瘤轉移、復發過程密不可分。多項研究表明，間質型標志物波形蛋白的過度表達與晚期肝細胞癌及更差的預后有較強相關性，因此，僅僅基于EpCAM識別捕獲肝癌循環腫瘤細胞會造成捕獲效率低、捕獲表型單一、臨床應用有限的問題。同時分離上皮型與間質型肝細胞癌CTC對于探究癌癥的形成機制、理解轉移侵襲過程等具有重要意義。

發明內容

本發明的主要目的，在于提供一種肝癌循環腫瘤細胞表型分析方法。

本發明解決其技術問題的所采用的技術方案是：

一種肝癌循環腫瘤細胞表型分析方法，包括如下步驟：

1)構建捕獲芯片，所述的捕獲芯片包括兩個處理單元，其中，每個處理單元包括：

由多個橫截面為三角形的微柱組成的微陣列、以及位于該三角形微陣列入口一側的進樣口和位于該三角形微陣列出口一側的出樣口；

其中，微陣列的采用如下排布方式：Dc＝1.4*G*(Δλ/λ)^0.48，其中G指微柱間的水平間距，λ為同一列中兩微柱中心的距離，Δλ指同一行中第二個三角形相對于第一個三角形的側向偏移值，Dc為微流控整體臨界尺寸；

第一處理單元的微陣列上修飾有設有上皮細胞粘附分子抗體，第二處理單元的微陣列設有去唾液酸糖蛋白受體抗體；

2)樣品分別從兩個處理單元的入口進入，并從出口流出；

3)對兩個處理單元捕獲后的循環腫瘤細胞通過免疫染色法鑒定上皮表型與非上皮表型。