[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)新型冠狀病毒的引物組和檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010142707.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111270011B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張薇;許紹坤;王耕;粟柯衡;袁雪濤;袁萬(wàn)立;石玉珊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南瑞栢泰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 劉靜培

1.一種用于檢測(cè)新型冠狀病毒的引物組，其特征在于，所述引物組包括；

第一引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示：AACACAGTCTGTACCGTCT；

第二引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示：TTCTTGGAAGCGACAACAA；

第三引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示：AGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGTATGTGGAAAGGTTAT；

第四引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示：AACGGGTTTGCGGTGTAAGTAGCCCTGTATACGACATCA；

第五引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示：GCGGAGTTGATCACAACTACA；以及

第六引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6所示：CGGCACAGGCACTAGTAC。

2.一種如權(quán)利要求1所述的引物組在非診斷目的的檢測(cè)新型冠狀病毒中的應(yīng)用。

3.一種如權(quán)利要求1所述的引物組在制備用于檢測(cè)新型冠狀病毒的試劑盒中的應(yīng)用。

4.一種用于檢測(cè)新型冠狀病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒包含如權(quán)利要求1的引物組，以及反應(yīng)濃縮液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用于檢測(cè)新型冠狀病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，第一引物和第二引物的濃度為40uM，第三引物和第四引物的濃度為5uM、第五引物和第六引物的濃度為20uM；所述陰性對(duì)照為不含新型冠狀病毒ORF1ab基因片段的空質(zhì)粒，所述陰性對(duì)照濃度為10ng/ml；所述陽(yáng)性對(duì)照為含新型冠狀病毒ORF1ab基因片段的重組質(zhì)粒，所述陽(yáng)性對(duì)照濃度為10ng/ml；所述反應(yīng)濃縮液包含DNA聚合酶、硫酸鎂、甜菜堿、熒光染料、dNTPs。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用于檢測(cè)新型冠狀病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)濃縮液中的DNA聚合酶的濃度為8U/ul，所述硫酸鎂的濃度為50mM，所述甜菜堿的濃度為5M，所述熒光染料的濃度為0.1mM，所述dNTPs的濃度為10mM。

7.一種權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述檢測(cè)試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣本中的病毒RNA，得到待檢測(cè)核酸樣本；

(2)將第一引物和第二引物、第三引物和第四引物、以及第五引物和第六引物等體積混勻，得到引物混合體系；

(3)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：將反應(yīng)濃縮液、所述引物混合體系和所述待檢測(cè)核酸樣本混合均勻，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線；

(4)根據(jù)所述擴(kuò)增曲線和溶解曲線判定所述樣本檢測(cè)結(jié)果，即完成了所述樣本的檢測(cè)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測(cè)試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，步驟(1)中，提取樣本中的病毒RNA使用的為磁珠法核酸提取試劑盒。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測(cè)試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，步驟(3)中，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為：反應(yīng)濃縮液15ul，引物混合體系6ul,待檢測(cè)核酸樣本4ul；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用定量PCR儀或恒溫?zé)晒釶CR儀：使用定量PCR儀時(shí)，直接設(shè)置80個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30s且在FAM通道采集熒光，68℃恒溫，設(shè)置98-80℃產(chǎn)物退火程序,循環(huán)完成后加溶解曲線分析；使用恒溫?zé)晒釶CR儀，設(shè)置為68℃，40分鐘，完成后加溶解曲線分析。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測(cè)試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，步驟(4)中，所述樣本檢測(cè)結(jié)果包含以下情況：擴(kuò)增曲線具有明顯“S”型曲線，且溶解曲線峰型單一且尖銳，則判定樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性結(jié)果；擴(kuò)增曲線沒(méi)有出現(xiàn)明顯“S”型曲線，則判定樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性結(jié)果；擴(kuò)增曲線有明顯“S”型曲線，但溶解曲線峰型不單一，判定為非特異性擴(kuò)增，非特異性擴(kuò)增視為陰性結(jié)果。