[發(fā)明專利]豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010142136.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-04
• 公開（公告）號(hào): CN111254131B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳祥貴;楊瀟;黃玉坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/18
• 分類號(hào): C12N9/18;C12Q1/46
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

本發(fā)明提供了一種豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，涉及農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以耐熱性強(qiáng)、適應(yīng)各種條件、在不同環(huán)境中能良好的生長(zhǎng)的豇豆種子為原材料提取豇豆粗酶液，并將提取液進(jìn)一步分離純化，具有產(chǎn)量大和來源廣的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明利用比色法和熒光法研究了所述豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白對(duì)農(nóng)藥毒死蜱、克百威的敏感性；同時(shí)還利用Native?PAGE對(duì)農(nóng)藥敵敵畏進(jìn)行敏感性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所述豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白對(duì)上述農(nóng)藥都有較好的敏感性，因而有很大的優(yōu)勢(shì)可以作為替代酶源用于酶抑制法的農(nóng)殘快檢中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

酶抑制法在農(nóng)殘中的應(yīng)用是在1951年提出的，其應(yīng)用廣泛也較早。酶抑制法的主要檢測(cè)原理是有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶與羧酸酯酶等有很強(qiáng)的抑制力，能進(jìn)一步影響酯酶酶促反應(yīng)中酶與底物反應(yīng)過程，從而影響底物與顯色劑的反應(yīng)，這種顯色反應(yīng)可以在生物體外反應(yīng)出農(nóng)藥的抑制力，通過觀察反應(yīng)體系的顏色變化或者酶與某種特定化合物結(jié)合后的理化信號(hào)強(qiáng)弱判定樣品中是否含有農(nóng)藥，以及農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)。一般情況下，在體外的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，農(nóng)藥的引入會(huì)使檢測(cè)用酶的酶活受到一定的影響，當(dāng)提高農(nóng)藥的加入量時(shí)，所用酶的酶活會(huì)減小，而酶對(duì)底物水解后生成的底物累積量是與酶活性正相關(guān)的，酶活力越大，產(chǎn)物則越多。主要方法有：檢測(cè)生成產(chǎn)物的醋酸變化量的ΔPH法；檢測(cè)生成產(chǎn)物醋酸的電位法；檢測(cè)生成產(chǎn)物醋酸與NaHCO₃反應(yīng)后進(jìn)一步生成二氧化碳，然后檢測(cè)二氧化碳產(chǎn)生的壓力；檢測(cè)水解產(chǎn)物與顯色劑作用后的顏色的比色法等。近年來市場(chǎng)上使用的農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)、農(nóng)藥殘留檢測(cè)設(shè)備大多都是基于酶抑制法的原理設(shè)計(jì)的。目前市場(chǎng)上也已經(jīng)研制出了多種基于酶抑制法原理的農(nóng)殘快速檢測(cè)試劑盒，且國(guó)外多個(gè)國(guó)家也將這類試劑盒作為在田間進(jìn)行初步篩查農(nóng)藥殘留量的主要手段。酶抑制法有著方法簡(jiǎn)單易于操作，成本低，檢測(cè)用時(shí)短，可行性高，樣品檢測(cè)量大，有時(shí)對(duì)樣品的要求不高，簡(jiǎn)單處理后即可檢測(cè)等特點(diǎn)，適合基層的技法人員、家庭及個(gè)人使用的檢測(cè)方法。作為目前市場(chǎng)使用最廣泛的方法，國(guó)內(nèi)也出臺(tái)了多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)其使用，如GB/T18625、GB/T18626、GB/T18630等。因此，在可期的未來，酶抑制法依然是農(nóng)殘快檢技術(shù)中一個(gè)非常重要的檢測(cè)方法。

酶抑制法在國(guó)內(nèi)廣泛推廣的這些年中，所使用的酶源主要有動(dòng)物來源的乙酰膽堿酯酶，酶源單一且提取成本昂貴，且易受酶濃度、底物種類與濃度、pH值等的影響。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種植物性來源的豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白，功效類似于乙酰膽堿酯酶，對(duì)多種農(nóng)藥敏感性高，可將其應(yīng)用于在酶抑制法農(nóng)殘快檢，且制備成本低廉、穩(wěn)定性好、保存期長(zhǎng)。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)將豇豆粉碎后與PB緩沖溶液混合后，震蕩提取，靜置2h后，離心得上清液；

(2)將所述上清液過凝膠層析柱分離純化，以PB緩沖液作為流動(dòng)相，流速設(shè)置為0.75mL/min，1.5MPa作為最大柱壓值，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為280nm，收集每個(gè)吸收峰下洗脫液；

(3)篩選所述洗脫液中比酶活為3～5U/μg，酶活＞0.6U/mL，且與氯化血紅素結(jié)合能力Kd值3.50μM的部分，得到所述豇豆血紅素鐵結(jié)合蛋白。

優(yōu)選的，步驟(1)所述豇豆粉碎后過100目篩，收集篩下成分，得豇豆粉；所述豇豆粉與所述PB緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1g：(20～30)mL。

優(yōu)選的，步驟(1)所述震蕩提取的溫度為38～42℃，震蕩頻率為10～20rpm，提取的時(shí)間為25～40min。

優(yōu)選的，步驟(2)所述凝膠過濾層析柱包括Superdex-75凝膠過濾層析柱。