[發(fā)明專利]一種結(jié)腸癌核酸適體的組織樣本快速篩選及其在檢測制劑中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010140426.2
• 申請日: 2020-03-03
• 公開（公告）號: CN111944821A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡小曉;譚蔚泓;馬藝菡;彭程;李娟
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/574
• 代理公司: 北京知本村知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發(fā)明公開了一種結(jié)腸癌核酸適體的組織樣本快速篩選及其在檢測制劑中的應(yīng)用。核酸適體的序列選自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或?qū)⑵溥M(jìn)行標(biāo)記修飾。本發(fā)明核酸適體具有與生物抗體相似甚至更加優(yōu)越的特性，主要體現(xiàn)在其具有特異性和高親和性，低毒性、低免疫原性，可體外合成且保存運輸便利等。利用本發(fā)明的核酸適體經(jīng)熒光基團(tuán)標(biāo)記后進(jìn)行早期結(jié)腸癌組織檢測時，操作簡單易行且檢測結(jié)果更為直觀。同時，本次發(fā)明的核酸適體為短鏈核酸序列，其體外合成成本較低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種核酸適體及其應(yīng)用，特別是涉及一種可用于結(jié)腸癌細(xì)胞及臨床結(jié)腸癌樣本組織檢測的核酸適體及其在制備結(jié)腸癌臨床診斷與治療試劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)腸癌是癌癥相關(guān)死亡率第二位的惡性腫瘤。大約95％的結(jié)腸癌是腺癌，其他罕見的類型包括淋巴瘤、腺鱗癌和鱗狀細(xì)胞癌。隨著人民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。結(jié)直腸癌也是美國最常見的惡性腫瘤之一，但2000~2013年，50歲以上成年人發(fā)病率下降32%，≥65歲人群的遠(yuǎn)端結(jié)腸癌的發(fā)病率下降最多，其可歸功于結(jié)腸癌早期篩查的普及。因此，早期診斷、早期治療對降低結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率十分重要。

目前結(jié)腸癌早期診斷的方法包括大便隱血檢測、結(jié)腸鏡檢測、糞便DNA突變檢測和糞便RNA特異性基因檢測，鋇灌腸等。其中結(jié)腸鏡檢測被認(rèn)為是診斷結(jié)腸癌的金標(biāo)準(zhǔn),但是它為侵入性檢查，需要腸道準(zhǔn)備，檢查過程中有發(fā)生并發(fā)癥如出血及穿孔危險，患者接受性不高，且花費較大。大便隱血檢測雖然為非侵入性檢測,但是檢查結(jié)果容易受飲食等因素的影響。糞便DNA突變檢測和糞便RNA特異性基因檢測為非侵入性檢測手段，患者適應(yīng)性較好，但對于篩查結(jié)腸癌而言靈敏度和特異性不夠理想。因此結(jié)腸癌檢測亟需開發(fā)一種準(zhǔn)確高效的分子識別探針。

核酸適體分為DNA適體和RNA適體，是經(jīng)過一系列篩選得到的人工合成的寡聚核苷酸，通常為20-50個堿基，可與靶分子物質(zhì)特異性結(jié)合。核酸適體利用其二級結(jié)構(gòu)與靶分子物質(zhì)結(jié)合，由于其結(jié)構(gòu)的多樣性，核酸適體具有較廣的靶標(biāo)范圍。此外，核酸適體還具有免疫源性低、分子量小、親和性強、特異性好的特點。核酸適體可在體外化學(xué)合成，易于改造和修飾，制備成本低且易于保存。利用適體與配體的高親和性來對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，有助于腫瘤的早期診斷、快速定位，進(jìn)而為疾病的藥物研制、靶向治療、預(yù)后等提供有力的研究手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人利用生工公司修飾的核酸適體文庫對臨床結(jié)腸癌組織進(jìn)行流式結(jié)合驗證，最終得到可以與結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480、HCT116）結(jié)合且不與人正常腸上皮細(xì)胞（FHs74Int）結(jié)合的核酸適體。因而，本發(fā)明的目的提供一種高度特異性、穩(wěn)定性、可用于結(jié)腸癌細(xì)胞檢測的適體及其在制備結(jié)腸癌臨床診斷與治療試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種檢測人早期結(jié)腸癌組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞的核酸適體，序列選自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或?qū)⑵溥M(jìn)行標(biāo)記修飾。

所述核酸適體，為52個堿基的短鏈核酸序列，主要通過對該核酸序列進(jìn)行熒光基團(tuán)標(biāo)記，通過熒光強弱檢測其與結(jié)腸癌細(xì)胞的結(jié)合能力。

此外還可在該核酸序列上連接放射性物質(zhì)、治療性物質(zhì)、生物素、或者酶標(biāo)記基團(tuán)，推進(jìn)該核酸適體在結(jié)腸癌診斷與治療中的應(yīng)用。將所述的核酸適體成為制備檢測結(jié)腸癌細(xì)胞的制劑。

所述的核酸適體，最優(yōu)選是下述序列：

其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5所示序列，或?qū)⑵溥M(jìn)行標(biāo)記修飾。

同時，本發(fā)明還提供所述的核酸適體在制備檢測或診斷結(jié)腸癌細(xì)胞的制劑中的用途。所述用途，是將所述核酸適體與待測細(xì)胞樣品搖床孵育，孵育完成之后再用洗滌緩沖液離心清洗，再通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。