[發(fā)明專利]短小蛇根草OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010140322.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-03
• 公開（公告）號(hào): CN111321151B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 開國銀;張錫晨;武超;郝小龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/76
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

本發(fā)明提供了一種短小蛇根草OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列及其應(yīng)用，從短小蛇根草中分離克隆了1071bp的OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的編碼框序列；構(gòu)建了含OpWRKY2基因的植物表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草莖段外植體，獲得過量表達(dá)OpWRKY2基因的短小蛇根草毛狀根；利用高效液相色譜法分析轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿的含量，結(jié)果表明過量表達(dá)OpWRKY2基因可以促進(jìn)短小蛇根草毛狀根中喜樹堿的積累；通過qRT?PCR分析、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合和瞬時(shí)激活喜樹堿合成基因OpTDC1的表達(dá)，從而提高喜樹堿的積累。本發(fā)明方法為生產(chǎn)具有廣譜抗癌療效的喜樹堿提供了一種新型優(yōu)質(zhì)藥源，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子提高短小蛇根草毛狀根中喜樹堿含量的方法。

背景技術(shù)

短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)隸屬于茜草科(Rubiaceae)蛇根草屬(Ophiorrhiza)，為雙子葉多年生草本植物。全草均可入藥，性味苦寒，具清熱解毒之效，民間用來治療高熱、百日咳和外傷感染等。短小蛇根草是繼喜樹和青脆枝之后發(fā)現(xiàn)的喜樹堿(Camptothecin，CPT)藥源植物。喜樹堿類化合物是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topo I)的特異性抑制劑，能夠抑制細(xì)胞的復(fù)制、生長(zhǎng)與繁殖，是一類廣譜的抗癌藥物。臨床上被用來治療結(jié)腸癌、直腸癌、卵巢癌等。然而單一的種植模式及匱乏的種質(zhì)資源嚴(yán)重制約了喜樹堿類抗癌藥物的供應(yīng)，無法滿足逐年增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。所以，提高喜樹堿的產(chǎn)量成為了近些年的研究熱點(diǎn)，通過代謝工程技術(shù)提高植物中次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量是一個(gè)行之有效的方法。近些年來轉(zhuǎn)錄因子作為研究熱點(diǎn)，被廣泛的報(bào)道能夠參與調(diào)控植物次級(jí)代謝。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其DNA結(jié)合區(qū)包含一至兩個(gè)WRKY核心結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的N端含有七個(gè)高度保守的氨基酸序列，即WRKYGQK，而其C端有一個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)。鋅指結(jié)構(gòu)主要有兩種形式：Cx_4-5Cx_22-23HxH和Cx₇Cx₂₃HxC。根據(jù)所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型的不同，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被劃分為三類。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能具有多樣性，包括：響應(yīng)生物脅迫與非生物脅迫、調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控植物代謝合成等。已有研究報(bào)道WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物次生代謝調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供短小蛇根草OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列及其應(yīng)用，短小蛇根草的OpWRKY2可以促進(jìn)短小蛇根草毛狀根中喜樹堿的積累；利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿生物合成基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)OpWRKY2基因可以明顯提高OpTDC基因的表達(dá)；通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合和瞬時(shí)激活喜樹堿合成基因OpTDC的表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種提高短小蛇根草毛狀根中喜樹堿含量的方法，并解析了OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控喜樹堿生物合成的分子機(jī)制，為生產(chǎn)具有廣譜抗癌療效的喜樹堿提供了一種新型優(yōu)質(zhì)藥源，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明從短小蛇根草中克隆得到OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子，所述OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因編碼框序列為1071bp；所述OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。構(gòu)建過表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草莖段獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根；qRT-PCR分析OpWRKY2及喜樹堿生物合成相關(guān)基因在毛狀根中的表達(dá)；高效液相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿的含量；利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)及雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明OpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合和激活喜樹堿合成的基因OpTDC1來調(diào)控喜樹堿的生物合成。

本發(fā)明還提供了一種多肽，所述多肽的基酸序列如SEQ ID NO.2所示。