[發(fā)明專利]一種自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010139910.3
• 申請(qǐng)日: 2020-03-03
• 公開（公告）號(hào): CN111440722A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖華;姜曉騰;張巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/00
• 分類號(hào): C12N1/00;C12M1/42
• 代理公司: 上海段和段律師事務(wù)所 31334
• 代理人: 李佳俊;郭國(guó)中

1.一種自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，包括如下步驟：

A、微生物組樣本中除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及黏蛋白；具體步驟為：

將微生物組樣本冷凍離心得到沉淀物，所述沉淀物包括微生物、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、黏蛋白；

對(duì)沉淀物通過重懸緩沖液進(jìn)行若干次重懸洗脫操作，通過濾膜過濾得到微生物組；

B、活化液活化處理步驟A得到的微生物組，得到適合電泳分離的活化微生物組；

C、在自由流等電聚焦電泳儀中加入載體緩沖液，使得分離腔中形成線性pH梯度；

D、將步驟B得到的活化微生物組采用步驟C的自由流等電聚焦電泳儀進(jìn)行自由流等電聚焦電泳分離。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，步驟A中所述重懸洗脫操作具體包括：通過重懸緩沖液吹吸沉淀物3次及以上，使沉淀物充分溶解于重懸緩沖液，并于渦旋儀上進(jìn)行5-10秒的渦旋，然后冷凍離心，棄去上清液，得到沉淀。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，所述重懸緩沖液為0.5％Triton X-100的PBS緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，所述冷凍離心具體包括：將微生物組樣本在4℃、8000-12000g離心力下離心5-10分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，步驟A中所述濾膜包括10μm孔徑的聚偏氟乙烯膜。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，步驟B中所述活化處理具體包括：將微生物組于4℃通過活化液重懸并用渦旋儀輕微震蕩處理20分鐘，得到活化微生物組。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，所述的活化液包括5mM CaCl₂。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，步驟C中所述載體緩沖液包括0.8％-1.2％Ampholyte、0.5％-1％Triton X-100、1.1g/L Ficoll、250-300mM Mannitol；所述線性pH梯度為：在pH 2.5-10.5范圍內(nèi)形成的線性梯度。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法，其特征在于，步驟D中所述自由流等電聚焦電泳分離具體包括：將活化微生物組置于已形成線性pH梯度的自由流等電聚焦電泳儀中，恒溫4-6℃，恒電壓300V，限流2-4mA，分離時(shí)間1-1.5小時(shí)。

10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法制備得到的微生物的應(yīng)用，其特征在于，所述自由流等電聚焦電泳微生物組分離制備的方法制備得到的微生物在微生物組學(xué)以及生物標(biāo)志物中的應(yīng)用。