[發(fā)明專利]一種外泌體保存液及外泌體的保存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010138739.4
• 申請(qǐng)日: 2020-03-03
• 公開（公告）號(hào): CN111226902B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭義;胡波;梁欣;楊菊紅;林列坤;曾君;王長(zhǎng)山;張慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）
• 主分類號(hào): A01N1/00
• 分類號(hào): A01N1/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

本發(fā)明涉及一種外泌體保存液及外泌體的保存方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的一種外泌體保存液，包括牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明還提供保存外泌體的保存方法，包括將本發(fā)明所述外泌體保存液置于85℃～95℃加熱10?30min，形成膠體溶液，再將外泌體保存于膠體溶液中。本發(fā)明中的外泌體保存液能夠長(zhǎng)期保持外泌體的完整性、生物活性以及內(nèi)含物穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種外泌體保存液及外泌體的保存方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

外泌體(exosomes)是一種由活細(xì)胞分泌，直徑在30-150nm，具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，它在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、腦脊液等各種體液中，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等生物活性成分。外泌體參與物質(zhì)運(yùn)輸，還攜帶和傳遞重要的生物信息，在介導(dǎo)免疫抗原遞呈、樹突狀細(xì)胞的活化、神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、腫瘤細(xì)胞抗原的轉(zhuǎn)移及腫瘤診斷治療中發(fā)揮重要作用，吸引了很多科研人員的關(guān)注，在深入研究外泌體前，外泌體的提取純化、鑒定及合理保存是首要的步驟，也是一切后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，只有高活性、高穩(wěn)定性的外泌體才能確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和可信度。

目前外泌體只能在2～8℃穩(wěn)定保存3天，-20℃穩(wěn)定保存1個(gè)月。長(zhǎng)期保存需要-80℃低溫，并且不能凍融，存儲(chǔ)條件要求高，這些缺點(diǎn)影響了外泌體的深入研究。

由此，有效保持外泌體的完整性、生物活性和內(nèi)含物穩(wěn)定性的外泌體保存液仍有待開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能長(zhǎng)期保持外泌體的完整性、生物活性以及內(nèi)含物穩(wěn)定性的外泌體保存液。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種外泌體保存液，所述外泌體保存液包括牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、甘油、二甲基亞砜(DMSO)和磷酸鹽緩沖液(PBS)。

目前，外泌體保存液種類極少，并且其保存液保存效果不佳，容易造成外泌體在保存過程中結(jié)構(gòu)被破壞，生物活性喪失，或內(nèi)含物降解，影響對(duì)外泌體的后續(xù)檢測(cè)、標(biāo)記等下游的研究或應(yīng)用。鑒于此，本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液的外泌體保存液能夠很好地保護(hù)外泌體，使其在2～8℃或-20℃下仍可以長(zhǎng)期保持形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物活性，且內(nèi)含物穩(wěn)定性較好。

本發(fā)明所述的外泌體保存液中，牛血清白蛋白的添加，增加了外泌體保存液體系中蛋白質(zhì)濃度，防止蛋白酶對(duì)外泌體膜蛋白的水解；海藻糖的添加，對(duì)外泌體具有較好的保護(hù)作用，在低溫條件下海藻糖能在外泌體表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持外泌體的生物活性；甘油的添加，使保存液具有抗凍性，在-20℃不會(huì)結(jié)冰，防止外泌體在保存和使用過程中因凍融產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)破壞；二甲基亞砜能夠快速穿透外泌體膜進(jìn)入外泌體中，降低冰點(diǎn)、進(jìn)一步防止保存液結(jié)冰，同時(shí)提高外泌體膜內(nèi)離子濃度，減少膜內(nèi)冰晶的形成，從而保護(hù)外泌體結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含物的穩(wěn)定性；磷酸鹽緩沖液與外泌體自然狀態(tài)下的pH值、滲透壓一致，具有維持外泌體滲透壓、控制酸堿平衡的作用，同時(shí)磷酸鹽緩沖溶液易與Ca²⁺離子、Mg²⁺離子以及重金屬離子締合生成沉淀，抑制外泌體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)以及多數(shù)酶的活性，進(jìn)一步保護(hù)外泌體結(jié)構(gòu)的完整性以及內(nèi)含物的穩(wěn)定性。

因此，本發(fā)明所述的外泌體保存液能長(zhǎng)期保持外泌體的完整性、生物活性以及內(nèi)含物穩(wěn)定性。

作為本發(fā)明所述的外泌體保存液的優(yōu)選實(shí)施方式，所述牛血清白蛋白的濃度為1～10g/L，進(jìn)一步較好地長(zhǎng)期保持外泌體的完整性，避免外泌體的結(jié)構(gòu)破壞。

作為本發(fā)明所述的外泌體保存液的優(yōu)選實(shí)施方式，所述海藻糖的濃度為10～50g/L，進(jìn)一步保護(hù)外泌體表面蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持外泌體的生物活性。