[發明專利]一種SMN1和SMN2基因拷貝數的檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202010138478.6
• 申請日: 2020-03-03
• 公開（公告）號: CN111218506B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 郭亦亦;邱一帆;鐘麗霞;李淑如
• 申請（專利權）人: 勝亞生物科技(廈門)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明涉及分子生物學診斷領域，具體涉及一種SMN1和SMN2基因拷貝數的檢測試劑盒。在一管PCR反應液中利用8種引物同時擴增SMN1第7外顯子、SMN1第8外顯子、SMN2第7外顯子、SMN2第8外顯子，同時以一組或兩組以上的管家基因監控PCR反應效率，通過毛細管電泳分析PCR產物以SMN1與SMN2基因皆為2拷貝數的SMA正常對照進行計算，對SMN1、SMN2基因拷貝數進行相對定量的檢測，計算出0、1、2、3、等于或大于4拷貝數的SMN1與SMN2基因，區分SMA患者、攜帶者或正常人。從DNA樣本開始，3小時內可以出結果，只需要一次PCR實驗即可檢測出SMN1與SMN2基因拷貝數情況，檢測技術流程簡單，容易實現標準化。

技術領域

本發明涉及分子生物學診斷領域，具體涉及一種SMN1和SMN2基因拷貝數的檢測試劑盒。

背景技術

脊髓性肌萎縮癥（SMA）為一種脊髓前角運動神經元退化變性導致肌無力、肌萎縮和癱瘓的疾病，根據發病年齡及臨床表現分為Ⅰ型（嚴重型）、Ⅱ型（中間型）、Ⅲ型（輕型）和Ⅳ型（成人型）。一般神經專科根據發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢，結合家族史和 SMN1 基因分析可進行確診。SMA Ⅰ型為最嚴重的亞型，患者在出生后6個月內發病，一般生存期在2歲以內；SMA Ⅱ型為中度型，患者通常在6~18個月內發病，其生存期仰賴于外來健康支援照護，可存活至成年；SMAⅢ型為輕度型，患者由出生后18個月至成年都有可能發病，其病情進展較為緩慢，最終仍死于呼吸肌麻痹，SMA Ⅳ型為成人型，30歲后發病，癥狀輕微，生存期正常。

SMN基因（Survival motor neuron）位于染色體5q11.2~q13.3 上，全長約為27kb，含有9個外顯子，分別為外顯子1、2a、2b、3、4、5、6、7和8，人基因組有兩個緊鄰的高度同源的SMN 基因為SMN1基因（survival motor neuron gene 1，運動神經元存活基因1）與SMN2基因（survival motor neuron gene 2，運動神經元存活基因2），兩基因序列上僅有5個堿基的差異，其中2個堿基位在第7、8外顯子上，另3個堿基則位在內含子6、7中。SMNl 是主要功能基因，該基因突變可導致 SMA 發病。SMN2為臨床表型的調節基因，影響病情的嚴重程度，其拷貝數增加可減輕SMA 表型。SMN1基因與SMN2基因的第7外顯子上存有關鍵的堿基差異，導致SMN2表達的蛋白無法取代SMN1基因的作用。SMN蛋白廣泛分布于全身組織，于腦部、脊髓與肌肉表達水評最高；當SMN基因缺失或突變時，會使得SMN蛋白的數目、結構與功能產生異常。當SMN蛋白數量低于運動神經元所需的最低含量時，就會導致運動神經元變性。95%以上SMA患者是由于SMN1 第7號外顯子和/或的第8號外顯子產生缺失或轉換所致，其余5%SMA患者為SMN1點突變或其他外顯子缺失導致。

目前已發展出許多方法用來進行SMA分子檢測，聚合酶鏈反應─限制酶片段長度多態性(PCR-RFLP)、變性高效液相分析(DHPLC)、多重連接探針擴增(MLPA) 、高分辨熔解曲線(HRM)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-Time qPCR)等技術。

聚合酶鏈反應─限制性酶切片段長度多態性（PCR-restriction fragmentlength polymorphism, PCR-RFLP，分別對SMN1基因和SMN2基因的第7、8外顯子進行PCR擴增，在第7外顯子中，限制性內切酶Dra I消化PCR擴增產物，SMN1片段上無Dra I切位點，不能被切割；SMN2片段采用錯配引物建構出Dra I位點，故能夠被酶切消化。同理，在第8外顯子中，由于SMN2片段存在限制性內切酶Dde I切位，使其酶切后產生兩片段，而SMN1無此位點，因此無法切割。PCR-RFLP操作方法簡便，結果清晰容易判讀，為臨床上常使用于SMN1基因為純合缺失的檢測方法，但缺點為可能因酶切未完全而造成假陰性的結果產生，同時這種方法只能檢測出純合缺失，無法確認雜合缺失。