[發明專利]一種蘋果花葉病的檢測方法

有效

• 申請號: 202010137576.8
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111118224B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 李興亮;張軍科;李民吉;周貝貝;張強;魏欽平
• 申請（專利權）人: 北京市林業果樹科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.一種蘋果花葉病的檢測方法，所述蘋果花葉病由李屬壞死環斑病毒(PNRSV)、蘋果壞死花葉病毒(ApNMV)或/和蘋果花葉病毒(ApMV)所引起，該PCR檢測體系中包括下述簡并引物：

SEQ ID No.1：5’–GAGAGGTTGGCAGTTSGWASCYCC-3’，

SEQ ID No.2：5’–CACTYACCACTAYGTAMAWATCC-3’，

其中，S＝G/C；W＝A/T；Y＝C/T；M＝A/C；

所述的檢測方法為實時熒光定量PCR檢測。

2.根據權利要求1所述的PCR檢測方法，所述PCR檢測為10μL反應體系：SYBR反應液5.0μL，10pM/μL SEQ ID No.1、SEQ ID No.2引物溶液各0.5μL，待測蘋果樣品cDNA模板1.0μL，RNase-free水3.0μL。

3.根據權利要求2所述的PCR檢測方法，所述待測蘋果樣品cDNA模板的制取方法為：提取待測蘋果樣品的總RNA，反轉錄為cDNA。

4.根據權利要求2所述的PCR檢測方法，所述PCR檢測的反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性15s，60℃退火15s，40次循環，每次循環第2步進行熒光采集；最后退火至65℃，每隔30s上升0.5℃至95℃變性1min，采集熒光強度，繪制溶解曲線。

5.根據權利要求4所述的PCR檢測方法，還包括判定步驟即根據溶解曲線Tm值判斷帶毒情況，具體為當Tm值介于81.0-83.0℃時，則待測蘋果樣品為蘋果花葉病植株；當Tm值不在81.0-83.0℃區間，則待測蘋果樣品為無蘋果花葉病的植株。

6.根據權利要求5所述的PCR檢測方法，所述待測蘋果樣品來自于蘋果的葉片、枝條、花或果實。

7.一種蘋果花葉病的分子檢測試劑盒，其特征在于，所述蘋果花葉病由下述病毒中至少一種所引起：李屬壞死環斑病毒(PNRSV)、蘋果壞死花葉病毒(ApNMV)和蘋果花葉病毒(ApMV)，該檢測試劑盒包含下述兩條簡并引物：

SEQ ID No.1：5’–GAGAGGTTGGCAGTTSGWASCYCC-3’，

SEQ ID No.2：5’–CACTYACCACTAYGTAMAWATCC-3’，

其中，S＝G/C；W＝A/T；Y＝C/T；M＝A/C。

8.根據權利要求7所述的分子檢測試劑盒，還包含SYBR反應液；其中SYBR反應液包括聚合酶、反應緩沖液和核酸染料SYBR GreenⅠ。

9.根據權利要求7所述的分子檢測試劑盒，所述蘋果花葉病的待測樣品來自于蘋果的葉片、枝條、花或果實。