[發明專利]壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒及其建立方法

在審

• 申請號: 202010137475.0
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111154904A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 孫東波;郭東華;李赫;蔣劍成;賀顯晶;王志慧;張思瑤;肖佳薇;汪鋒鋒;王麗娜;丁夢圓
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;G01N21/84;G01N1/28;G01N1/30;C12R1/01
• 代理公司: 西安研創天下知識產權代理事務所(普通合伙) 61239
• 代理人: 楊鳳娟

1.壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于，包括30μL的上游引物lktA-F和30μL的下游引物lktA-R的，所述上游引物lktA-F與下游引物lktA-R的序列分別為：

lktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC 3'；

lktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC 3'。

2.根據權利要求1所述的壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括1000μL的2×premix預混酶，1000μL的超純水，30μL的DNA Marker DL2000，30μL的陰性對照及30μL的陽性對照，所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R的濃度為10μM。

3.根據權利要求2所述的壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照為去離子水；所述的陽性對照為壞死桿菌A25菌基因組DNA。

4.根據權利要求2所述的壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒的建立方法，其特征在于，所述的PCR診斷試劑盒的建立方法包括以下步驟：

步驟一：培養壞死桿菌A25菌

將A25菌加入苛氧厭氧液體培養基中進行培養備用；

步驟二：細菌革蘭氏染色鑒定

對步驟一培養的每代細菌需要進行細菌革蘭氏染色鑒定，將細菌菌液取2.5μL直接涂于載玻片，酒精燈外焰固定，使用革蘭氏染液染色；

步驟三：提取細菌基因組

選取5mL步驟一培養的活力在最好狀態的壞死桿菌A25的菌液，進行離心、洗滌后，運用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養備用的細菌的細菌基因組；

步驟四：設計壞死桿菌白細胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物

依據已經提交于GenBank上的壞死桿菌A25菌株白細胞毒素的核苷酸序列在NCBI上進行設計，利用Primer-BLAST方法設計壞死桿菌白細胞毒素基因lktA的引物，將所選的引物進行合成，設計出上游引物lktA-F和下游引物lktA-R；

步驟五：PCR方法的建立

設計出壞死桿菌白細胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物后，經過實驗，設計最佳反應溫度，以步驟三提取的壞死桿菌A25菌株的基因組為模板，用lktA引物對基因組進行PCR擴增；

步驟六：利用陰性對照及陽性對照的結果證明，用引物均可以擴增出其目的條帶，目的條帶片段大小為1700bp，無非特異性片段產生，結果表明壞死桿菌白細胞毒素基因PCR檢測方法建立成功。

5.根據權利要求4所述的壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒的建立方法，其特征在于，步驟一所述的培養壞死桿菌A25菌的具體步驟為：

S1.將A25菌以1:100的比例加入苛氧厭氧液體培養基中，在厭氧培養箱中培養，培養溫度為37℃，培養時間為24h-48h，當菌液變為乳白色均一渾濁液為宜；

S2.將所述乳白色均一渾濁的菌液繼續以1:100的比例接種于苛氧厭氧液體培養基中，進行傳代培養；

S3.傳代培養3-4代，使細菌活力達到最好狀態備用。

6.根據權利要求4所述的壞死桿菌白細胞毒素基因PCR診斷試劑盒的建立方法，其特征在于，步驟二所述的細菌革蘭氏染色鑒定的具體步驟包括：

S1.將細菌菌液取2.5μL直接涂于載玻片，酒精燈外焰固定；

S2.首先將Ⅰ號結晶紫染色液加在已被固定的細菌載玻片上，染色1min后，用蒸餾水緩慢沖洗剩余染色液；

S3.然后在細菌載玻片上再滴加Ⅱ號革蘭氏碘液，染色1min后，用蒸餾水緩慢沖洗剩余染色液；

S4.隨后滴加Ⅲ號95％酒精液到細菌載玻片上，夏季脫色30s，冬季脫色1min；

S5.最后使用Ⅳ號沙黃染色液對細菌載玻片染色1min，用濾紙吸干載玻片上水分，在顯微鏡下觀察，觀察時使用顯微鏡油鏡觀察革蘭氏染色的壞死桿菌A25菌株。