[發明專利]一種鑒定達氏鱘基因組大小及倍性的方法

有效

• 申請號: 202010136936.2
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111154849B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 陳葉雨;龔全;賴見生;劉亞;宋明江
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院水產研究所（四川省水產研究所）
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B30/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 鄒仕娟

本發明公開了一種鑒定達氏鱘基因組大小及倍性的方法，包括對達氏鱘總DNA經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增完成整個文庫制備，進行進行PE測序，得到的原始數據過濾得到有效數據，采用采用基于K?mer的分析方法來估計基因組大小，計算雜合率。本發明方法多倍體物種基因組大小及倍性的鑒定提供了一種參考方案。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種鑒定達氏鱘基因組大小及倍性的方法。

背景技術

達氏鱘是一種淡水定居性魚類，常在江河中下層活動，喜棲息于流速較緩、富腐植質和底棲生物的沙質底或卵石磧壩的河灣或深沱中，生長速度較快，一般體長0.8～1.0米，體重5～10公斤，國家一級保護動物。

張四明等1999年，利用細胞DNA含量測定的方法，對達氏鱘染色體數目進行了預測。采用Feulgen-顯微分光光度計方法，以雞紅細胞為標準DNA(3.22pg2/c)測定了達氏鱘的體細胞基因組大小(DNA含量)。結果表明，達氏鱘DNA含量為8.26pg，初步判斷其為八倍體物種。而隨后Rajkov等(2014)利用微衛星共顯性遺傳方式的原理，通過計算個體不同位點的等位基因數目來評估了達氏鱘的倍性。Rajkov等采用微衛星遺傳標記法，通過20個位點的等位基因對9尾達氏鱘個體的多倍體倍性進行了分析，認為其應該屬于四倍體物種。

由于細胞DNA含量測定與微衛星測定兩種方式各存在其相應的局限性，導致研究結果相互不一致。對于細胞DNA含量測定法，標準DNA有人淋巴細胞、雞紅細胞等。就雞紅細胞而言，其絕對DNA含量也不一致，因此導致即使同一條魚，其測定的結果不一定完全一樣，結果存在一定的偏差。加之，達氏鱘為多倍體物種，一方面其細胞核較大會造成核質分布不均勻；另一方面，除常規染色體以外，鱘魚還存在微型染色體，微型染色體占大染色體總數的1/2到1/3，而微型染色體是否也像大染色體一樣呈加倍關系，還未研究透徹，所以通過細胞DNA含量測定法來鑒定多倍體物種倍性的準確性不高。

對于利用微衛星標記鑒定物種倍性的方法也有待商榷。一方面，動物染色體上存在許多重復區域，而若使用的微衛星恰好處于染色體的重復區域，就會導致倍性鑒定結果加倍。另一方面，在使用微衛星標記鑒定倍性時所用的標記數量十分有限，結果存在一定的偶然性，并不一定能準確反映物種的真實倍性情況。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鑒定達氏鱘基因組大小及倍性的方法，從全基因組的層面對達氏鱘基因組大小進行了鑒定，可獲得精確的基因組大小和倍性。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種鑒定達氏鱘基因組大小及倍性的方法，包括以下步驟：

1)對達氏鱘肌肉樣本進行總DNA提取；

2)將樣品DNA隨機打斷成長度為350bp的片段，經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增完成整個文庫制備；

3)將構建的文庫進行PE測序，得到的原始數據過濾得到有效數據；

4)采用基于K-mer的分析方法來估計基因組大小；

5)通過以下公式計算雜合率；

其中，a_1/2為雜合K-mer種類數的百分比，n_kspecies為所有K-mer的種類數，K為K-mer長度。

進一步的，所述過濾具體包括以下步驟：

1)過濾掉含有接頭序列的reads；

2)當單端測序read中含有的N的含量超過該條read長度比例的10％時，去除此對paired?reads；