[發明專利]一種用于布魯氏菌RPA擴增的引物組、可視化檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010136433.5
• 申請日: 2020-03-02
• 公開（公告）號: CN111154903A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 任洪林;張士軍;柳溪林;張英;胡盼;盧士英;柳增善;李巖松;祝萬菊;閆守慶
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

本發明提供了一種用于布魯氏菌RPA擴增的引物組、可視化檢測試劑盒及應用，屬于分子生物學檢測技術領域；所述引物組包括上游引物和下游引物。利用本發明的引物組對布魯氏菌進行RPA擴增，結合SYBR Green I可對布魯氏菌進行現場可視化檢測，本發明不依賴PCR儀等熱循環儀器，利用RPA技術對布魯氏菌核酸進行擴增，擴增結束后使用395nm波長的紫外燈進行照射，觀察反應體系是否呈現熒光判定檢測結果，本發明的引物組具有特異性強、敏感性好，所發明的試劑盒操作簡單、檢測快速、結果可視化等優點，為布魯氏菌的現場可視化檢測提供新的方法。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種用于布魯氏菌RPA擴增的引物組、可視化檢測試劑盒及應用。

背景技術

布魯氏菌(Brucella)又稱布氏桿菌，是一種革蘭氏陰性的不運動細菌，可以在牛、羊、豬等多種家畜體內存活。

目前我國對布魯氏菌的檢測主要以細菌學、血清學檢測方法為主，這些方法存在著費時費力，假陽性等缺點。隨著分子生物學技術的發展，PCR方法逐步用于布魯氏菌的鑒定。但PCR技術本身存在依賴PCR儀、易污染、靈敏度和特異性有待于進一步提高等問題，而且擴增產物需要經過進一步瓊脂糖凝膠電泳或熒光定量檢測等設備才能得到檢測結果，不能實現布魯氏菌的可視化檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于布魯氏菌RPA擴增的引物組、可視化檢測試劑盒及應用，本發明的方法具有特異性強、靈敏度高、能夠可視化檢測的優點。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種用于布魯氏菌RPA擴增的引物組；所述引物組包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明提供了一種包括上述方案所述引物組的試劑盒。

優選的，所述試劑盒還包括醋酸鎂水溶液、RPA反應緩沖液、RPABasic凍干粉、50×SYBR Green I和無菌水。

優選的，所述試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品；所述陽性對照品包括布魯氏菌的基因組DNA；所述陰性對照品包括無菌水。

本發明提供了上述方案所述引物組或者所述試劑盒在非診斷目的的布魯氏菌RPA擴增中的應用，所述應用包括以下步驟：

1)提取待檢測樣品的基因組DNA；

2)以待檢測樣品的基因組DNA為模板，利用上述方案所述引物組進行RPA擴增反應，得到RPA擴增產物；

3)將所述RPA擴增產物和50×SYBR Green I混合，離心，用395nm波長的紫外燈照射，觀察擴增產物的產生熒光情況，若擴增產物呈現熒光，則樣品中含有布魯氏菌，若擴增產物不呈現熒光，則樣品中不含布魯氏菌。

優選的，步驟2)中還包括分別以布魯氏菌的基因組DNA和無菌水為模板進行RPA擴增；所述以布魯氏菌的基因組DNA為模板的RPA擴增結果作為陽性對照，以無菌水為模板的RPA擴增結果作為陰性對照。

優選的，步驟2)中所述RPA擴增反應的反應體系以50μL計包括：2μL模板、12.4μL無菌水、29.5μL RPA反應緩沖液、上下游引物各1.8μL，2.5μL醋酸鎂水溶液和4mg RPABasic凍干粉；

所述醋酸鎂水溶液中醋酸鎂的濃度為280mM；所述上游引物和下游引物的濃度分別為10μM；所述模板的濃度為0.1μg/μL。

優選的，步驟2)中所述RPA擴增反應的程序為：37～42℃擴增10～20min。

優選的，以RPA擴增的擴增體系為50μL計，步驟3)中所述50×SYBR Green I的用量為1～2μL。