[發明專利]一種靶向四環素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除載體、載體構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010132908.3
• 申請日: 2020-02-29
• 公開（公告）號: CN111378660B
• 公開（公告）日: 2021-08-06
• 發明（設計）人: 陳紅;林澤俊;朱琳;周振超
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

1.特異性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA，其特征在于，該sgRNA靶向tetA基因的第251位至第270位的序列，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG -3’。

2.含有權利要求1所述的特異性靶向tetA基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除載體。

3.一種構建權利要求2所述的CRISPR/Cas9基因敲除載體的方法，其特征在于，包括：

（1）根據權利要求1或2所述靶向切割tetA基因的sgRNA，合成含有該sgRNA的表達元件sgRNA（tetA），該表達元件sgRNA（tetA）包含原核生物J23119 (SpeI)啟動子、編碼基因的核苷酸序列為：5’- CATGATGGCGTAGTCGACAG -3’的sgRNA、gRNA scaffold序列和終止子序列，其序列如SEQ ID No.2；將該表達元件sgRNA（tetA）插入到puc57載體中，得到載體puc57-sgRNA(tetA)；

（2）利用無縫克隆技術在上述（1）所述的puc57-sgRNA(tetA)載體內插入接合轉移位點（OriT），得到puc57-oriT- sgRNA(tetA)質粒；

（3）將上述（2）所述的puc57-oriT- sgRNA(tetA)質粒和pCas質粒中的目的片段分別PCR擴增，利用無縫克隆技術得到puc57-oriT- Cas9-sgRNA(tetA)質粒。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）的PCR反應程序為 98℃變性10s，55℃退火10s，延伸溫度為72℃，速度為5s/kb，循環數為30；所述的PCR反應體系為PrimeSTAR Max Premix 25 μ l ，上下游引物各1 μ l ，模板1 μ l ，ddH₂O 22 μ l ；所述的無縫克隆反應體系為NovoRec plus重組酶1 μ l ，5×緩沖液4 μ l ，長片段0.05pmol，短片段為0.025pmol，用ddH₂O將反應體系補充至20 μ l ，50℃反應15分鐘。

5.含有權利要求2所述的CRISPR/Cas9基因敲除載體的微生物，該微生物為大腸桿菌。

6.權利要求1所述的sgRNA在四環素抗性基因tetA敲除中的應用。

7.權利要求2所述的CRISPR/Cas9基因敲除載體在四環素抗性基因tetA敲除中的應用。

8.權利要求5所述的微生物在四環素抗性基因tetA敲除中的應用。