[發明專利]基于仿生納米微結構芯片、內毒素毒SERS定量檢測系統、方法及應用

有效

• 申請號: 202010131767.3
• 申請日: 2020-02-29
• 公開（公告）號: CN111257300B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 徐溢;項松濤;陳李
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;B01L3/00;B82Y30/00;B82Y5/00;B82Y15/00
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.一種內毒素檢測系統，其特征在于，包括SERS標簽和仿生納米微結構芯片；所述SERS標簽是由核酸適配體修飾的SERS標簽，所述核酸適配體是氨基或羧基修飾的核酸適配體，所述核酸適配體與拉曼報告分子上的活性基團連接構成SERS標簽；所述芯片是將蟬翅作為仿生SERS模板，在其表面濺射金膜作為SERS基底，將其集成在陣列式微米培養腔內而構成。

2.根據權利要求1所述的內毒素檢測系統，其特征在于，所述芯片包括以載玻片為襯底粘貼具有陣列小孔的亞歷克板形成的陣列式三維SERS納米仿生基底，對位并鍵合在基底上的PDMS打孔層，以及鍵合在PDMS打孔層之上的PDMS蓋片層與培養基補充層，其中由陣列小孔和對應的PDMS打孔層上的孔共同形成的陣列孔就形成所述的陣列式微米培養腔，濺射有金膜的蟬翅粘貼在每個微米培養腔內。

3.根據權利要求1所述的內毒素檢測系統，其特征在于，所述芯片上的每個微米培養腔體積10~50μL。

4.根據權利要求1所述的內毒素檢測系統，其特征在于，所述SERS標簽是通過如下方式獲得：

利用1,6-己二胺 (1,6-Hexamethylenediamine, HMD) 作為交聯劑，將銀納米顆粒制成銀納米粒子二聚體，作為SERS增強材料與載體；

通過Ag-S鍵連接帶巰基的拉曼報告分子；

加入氨基或是羧基修飾的核酸適配體與拉曼報告分子上的活性基團連接；

經巰基化的聚乙二醇表面封閉，制成內毒素檢測用SERS標簽。

5.根據權利要求4所述的內毒素檢測系統，其特征在于，所述拉曼報告分子包括4-巰基苯甲酸（4-MBA）和對氨基苯硫酚（PTAP）。

6.根據權利要求4所述的內毒素檢測系統，其特征在于，所述核酸適配體選自廣譜型內毒素核酸適配體，CTTC TGCC CGCC TCCT TCCA CCGA TCCA TCGA GTTT CTGA GAAA GGCCCGGA GAAA CCGC GAGA GGAG ACGA GATA GGCG GACACT及ATAG GAGT CACG ACGA CCAG CCTTCTAA CAGA ATGT TGTT GTTA GATA GCTT TGAA GCTG GTCT ATGT GCGT CTAC CTCT TGA；對綠膿桿菌產的內毒素有著更好特異性的CCTT CTAA CAGA ATGT TGTT AGAT AGC；對鼠傷寒沙門氏菌產內毒素有著更好特異性的ATAG GAGT CACG ACGA CGAC CAGG GGTT GTAG TAACTGAC ACGG CGAG AACC AACG CCTG GGCT ATGT GCGT CTAC CTCT TGA，AATG CCCG GTAGTTAT TCAA AGAT GAGT AGGA AAAGA 及AATG CCCG GTAG TTAT TCAA AGAT GAGT AGGA AAAGAAAT GCCC GGTA GTTA TTCA AAGA TGAG TAGG AAAAGA；對副溶血性弧菌產內毒素有著更好特異性的CTAA AAAT GGGC AAAG AAAC AGTG ACTC GTTGA；對大腸桿菌產內毒素有著更好特異性的CCGA AGCT TGGG AGCC AACA CCAC AATCAA 及CCGA AGCT TGGG AGCCA。

7.權利要求1-6任一項所述內毒素檢測系統的用途，其特征在于，用于多種生化體系中內毒素含量的檢測，用于細菌與抗菌藥物作用后內毒素含量監測，以及生化樣本中細菌原位培養并實時檢測內毒素。

8.采用權利要求1-6任一項所述內毒素檢測系統進行內毒素檢測的方法，其特征在于，所述方法包括：

將梯度濃度的內毒素標準品加入到陣列式三維SERS納米仿生微結構芯片中，并加入SERS標簽，結合時間控制在10-600 s內；

通過移動陣列式三維SERS納米仿生微結構芯片使得入射光斑恰好在每個檢測腔中，采集結合內毒素前后樣本的SERS光譜，以對氨基苯硫酚（PTAP）為拉曼報告分子，以DMSO為檢測內標，根據I₆₃₆/I₆₇₁峰強比變化確定結合時間，并建立內毒素濃度與峰強比的標準曲線；

在待測樣本或反應體系中加入SERS標簽，在確定的反應時間后采集SERS光譜信號，根據所建立的標準曲線得出各個樣本或是時間點的內毒素含量。