[發(fā)明專利]新型黃酮羥基化酶、合成黃酮碳苷類化合物的微生物及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010129425.8
• 申請(qǐng)日: 2020-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN113322288A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王勇;孫雨偉;陳卓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心
• 主分類號(hào): C12P7/26
• 分類號(hào): C12P7/26;C12P17/06;C12N9/02;C12N1/21;C12N1/19;C07D311/32;C07D407/04;C12R1/19;C12R1/465
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明提供了新型黃酮羥基化酶、合成黃酮碳苷類化合物的微生物及其應(yīng)用。本發(fā)明人克隆獲得了新型的黃酮羥基化酶PhF2H、PhF3’H，其屬于細(xì)胞色素P450羥基化酶，具有對(duì)于化合物特定位置進(jìn)行羥基化的功能。進(jìn)一步地，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)于所述酶的改造、結(jié)合運(yùn)用碳苷糖基轉(zhuǎn)移酶、黃酮前體合成途徑的組裝，在人工重組表達(dá)系統(tǒng)中高效地合成了黃酮碳苷類化合物如葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素，及其合成途徑中相關(guān)的中間體圣草酚、2?羥基柚皮素等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及合成生物學(xué)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及新型黃酮羥基化酶、合成黃酮碳苷類化合物或其中間體的微生物、其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

竹自古以來(lái)作為一種藥食兩用的植物在民間廣為流傳。《中藥大辭典》記載“竹葉清熱除煩，生津利尿”指明竹葉的食用價(jià)值；而《文經(jīng)逢源》記載：“竹葉兼行肌表，能療瘡殺蟲”亦標(biāo)明其外用藥效；竹葉在江南地區(qū)作為一種清熱敗火茶飲而廣為流傳。竹葉中最主要的黃酮提取物為四種碳苷黃酮化合物：葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素。

碳苷類黃酮化合物是以黃酮C6-C3-C6結(jié)構(gòu)為母核，糖基直接與母核以C-C鍵相連的化合物。碳苷類黃酮相對(duì)于氧苷類黃酮更為稀有，迄今為止從自然界中分離到的碳苷黃酮有幾十種，按照黃酮的母體結(jié)構(gòu)可分為碳苷黃酮類、黃酮醇碳苷類、雙碳苷黃酮類化合物，而其中以碳苷黃酮類化合物存在最為廣泛。根據(jù)報(bào)道，碳苷黃酮類化合物具有顯著的抗氧化作用，可以顯著性抑制外源性以及內(nèi)源性自由基；同時(shí)，其具有一定程度抑制細(xì)菌病毒的作用；碳苷黃酮類化合物也具有調(diào)節(jié)血脂的作用，可以顯著性地降低血液中總膽固醇的含量，并且具有治療心腦血管疾病的藥物活性；同時(shí)碳苷黃酮類化合物具有顯著性抗輻射以及神經(jīng)保護(hù)的作用；有調(diào)查表明碳苷黃酮類化合物具有相關(guān)抗代謝疾病的作用，對(duì)于糖尿病、肥胖等疾病均具有一定的治療效果。

與大多數(shù)天然產(chǎn)物一樣，幾種碳苷黃酮化合物的通過(guò)化學(xué)有機(jī)合成的方法十分困難。現(xiàn)階主要段獲得依從植物中進(jìn)行有機(jī)試劑萃取的方法。在此過(guò)程中需要大量的有機(jī)溶劑，還存在隨后的分離工藝繁瑣，工業(yè)化造價(jià)高等問(wèn)題。最主要的是該方法還會(huì)遇到植物生長(zhǎng)緩慢的瓶頸問(wèn)題。

現(xiàn)階段隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，利用微生物作為底盤細(xì)胞，通過(guò)外源基因的導(dǎo)入以及微生物反應(yīng)器發(fā)酵手段定向合成目標(biāo)產(chǎn)物為越來(lái)越普遍的一種技術(shù)。微生物具有遺傳操作簡(jiǎn)便、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于傳統(tǒng)的植物提取手段，微生物發(fā)酵具有速度快、受天氣氣候影響較小等優(yōu)勢(shì)，并且一些中間產(chǎn)物更易獲得；部分化合物通過(guò)微生物合成的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于植物提取，已經(jīng)成為天然產(chǎn)物獲得的一種重要手段。

目前，尚無(wú)于大腸桿菌中高效合成碳苷黃酮化合物的報(bào)道，因此本領(lǐng)域亟待進(jìn)行有效的探索，以期找到此類化合物的高效合成途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供新型黃酮羥基化酶、合成黃酮碳苷類化合物或其中間體的微生物、其制備方法及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種催化黃烷酮(類)化合物的C-2位或C-3’位羥基化的方法，包括：以新型黃酮羥基化酶進(jìn)行所述催化；其中，所述新型黃酮羥基化酶為SEQ IDNO:1所示的多肽或其保守性序列變體，其催化黃烷酮(類)化合物的C-2位羥基化；或所述新型黃酮羥基化酶為SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列變體，其催化黃烷酮(類)化合物的C-3’位羥基化。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述黃烷酮(類)化合物具有式(I)的母核結(jié)構(gòu)，C-2位羥基化后形成式(II)母核結(jié)構(gòu)(開環(huán)形式)的化合物，C-3’位羥基化后形成式(III)母核結(jié)構(gòu)的化合物；

在另一優(yōu)選例中，A環(huán)或B環(huán)中，存在1、2或3個(gè)羥基。

在另一優(yōu)選例中，所述的黃烷酮(類)化合物包括(但不限于)：柚皮素，圣草酚，松屬素，橙皮素，櫻花素。