[發明專利]一種檢測人類免疫缺陷病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 202010128132.8
• 申請日: 2020-02-28
• 公開（公告）號: CN111206117A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 劉一博;金鑫浩;任魯風;張未來;于軍
• 申請（專利權）人: 寧波胤瑞生物醫學儀器有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 張黎

1.一種檢測人類免疫缺陷病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括引物探針預混液；

所述的引物探針預混液包括HIV-cDNA的引物對、人GAPDH基因的引物對、HIV-cDNA的熒光探針和人GAPDH基因的熒光探針；

所述HIV-cDNA的引物對為：

上游引物：5’-TTGACTAGCGGAGGCTAGA-3’；

下游引物：5’-CCCTGGCCTTAACCGAAT-3’；

所述人GAPDH基因的引物對為：

上游引物：5’-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3’；

下游引物：5’-CGCCCAATACGACCAAATCAGA-3’；

所述HIV-cDNA的熒光探針的核苷酸序列為：

5’-CTGACGCTC+TCGCACCCATCTCTC-3’；

所述人GAPDH基因的熒光探針的核苷酸序列為：

5’-TCCGGGTGA+TGCTTTTCCTAGA-3’；

其中“+”表示3’端的堿基為鎖核酸修飾堿基。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述HIV-cDNA和/或人GAPDH基因的熒光探針的5’端含有熒光報告基團FAM和/或CY3，3’端含有熒光淬滅基團BHQ-1和/或BHQ-2。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的HIV-cDNA的熒光探針的5’端含有熒光報告基團FAM，3’端含有熒光淬滅基團BHQ-1；

所述的人GAPDH基因的熒光探針的5’端含有熒光報告基團CY3，3’端含有熒光淬滅基團BHQ-2。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物探針預混液中用于檢測HIV-cDNA的引物對、人GAPDH基因的引物對、HIV-cDNA的熒光探針和人GAPDH基因的熒光探針的濃度比為2:2:1:1。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽性質控品和陰性質控品；

所述的陽性質控品是由包含20000copies/μL的HIV-cDNA片段的質粒與等體積的10ng/μL的人正常T淋巴細胞系DNA混合而成；所述的陰性質控品是10ng/μL的人正常T淋巴細胞系DNA。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括反應預混液：dATP、dCTP、dGTP、dUTP、BSA、熱啟動Taq酶、尿嘧啶-DNA-糖基酶、ROX、TritonX-100和熱穩定焦磷酸酶。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的反應預混液中dATP、dCTP、dGTP、dUTP濃度均為0.4mM，BSA濃度為10μg/μL，ROX濃度為100nM，TritonX-100濃度百分比為0.2％，熱穩定焦磷酸酶為0.2U。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的熱啟動Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基酶的濃度比為0.5-1.5:1。

9.根據權利要求1-8任意一項所述的試劑盒在芯片式數字PCR平臺上檢測HIV-cDNA中的應用。

10.一種利用權利要求1-8任意一項所述的試劑盒檢測人類免疫缺陷病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：

(1)制備數字PCR反應體系：將待測的DNA模板與權利要求1-8任意一項所述的試劑盒中的引物探針預混液和反應預混液混合，得到數字PCR反應體系；

所述的PCR反應體系中待測的DNA模板、引物探針預混液、反應預混液的體積比為1:2:4-6；

(2)根據步驟(1)得到的數字PCR反應體系，制作PCR微反應單元，進行PCR擴增反應，得到擴增產物；

擴增條件為：37℃UDG消化300s，95℃熱啟動10min，1個循環；95℃變性15s，60℃延伸45s，共進行40個循環；10℃終止反應；

(3)對步驟(2)得到的擴增產物進行熒光信號收集，根據熒光信號的類型判斷待測樣品中是否含有人類免疫缺陷病毒的DNA模板及其數量和含量。