[發(fā)明專利]一種制備小菜蛾RDL亞基敲除品系的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010127066.2
• 申請日: 2020-02-28
• 公開（公告）號: CN111363745B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐漢虹;王坤坤;林菲;李本杰;陳冬平
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;C12N15/90;A01K67/033
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞

1.一種制備小菜蛾RDL亞基敲除品系的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)選擇RDL基因敲除靶點(diǎn)；

（2）體外合成sgRNA：設(shè)計(jì)sgRNA模板的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增，得到sgRNA模板，體外轉(zhuǎn)錄，純化，得到sgRNA；

（3）顯微注射：將步驟（2）體外合成的sgRNA與Cas9蛋白混合，孵育，顯微注射到小菜蛾卵中；

（4）培育靶點(diǎn)敲除小菜蛾：將步驟（3）顯微注射后的小菜蛾卵孵化，得到的G0代和同代G0代自交或者和野生型雜交，得到突變體G1代，之后對G1代連續(xù)多代自交，得到純合突變體，即小菜蛾RDL亞基敲除品系；

步驟（1）中所述的RDL基因敲除靶點(diǎn)包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的RDL1基因敲除靶點(diǎn)；

核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的RDL2基因敲除靶點(diǎn)；

步驟（2）中所述的sgRNA模板的擴(kuò)增引物從5’端到3’端包括以下可操作性元件：額外序列、T7啟動(dòng)序列、G（s）堿基，RDL基因敲除靶點(diǎn)序列以及sgRNA質(zhì)粒模板序列；

步驟（2）中所述的sgRNA模板的擴(kuò)增引物序列PxRDL1-gRNAF和PxRDL2-gRNAF如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示；

步驟（3）中所述的孵育為37℃孵育15 min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備小菜蛾RDL亞基敲除品系的方法，其特征在于：步驟（3）中所述的sgRNA的用量為按其與所述的Cas9蛋白以質(zhì)量比1：2混合。

3.權(quán)利要求1~2任一項(xiàng)所述的制備小菜蛾RDL亞基敲除品系的方法在研究小菜蛾抗性中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備小菜蛾RDL亞基敲除品系的方法在研究小菜蛾抗性中的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟：將權(quán)利要求1~2任一所述的方法制備而得的RDL敲除的小菜蛾品系使用苯基吡唑類藥物進(jìn)行室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)，研究小菜蛾的抗藥性。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備小菜蛾RDL亞基敲除品系的方法在研究小菜蛾抗性中的應(yīng)用，其特征在于：所述的苯基吡唑類藥物為氟蟲腈。