[發(fā)明專利]一種鮮、干金錢白花蛇的分子鑒別方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010127042.7
• 申請(qǐng)日: 2020-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN111206105A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 晁志;李嬋;葉浩婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 李玉娜

本發(fā)明公開了一種鮮、干金錢白花蛇的分子鑒別方法，提取待測(cè)樣品的基因組DNA，用提取的基因組DNA作為模板，利用特異引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，若熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽性反應(yīng)，出現(xiàn)特異性的S形熒光擴(kuò)增曲線且Cq值為11.72?30.74的即為金錢白花蛇；若熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性反應(yīng)，未見特異性的熒光擴(kuò)增曲線或出現(xiàn)熒光值增長且Cq值大于30.74的即為混偽品或金錢白花蛇含量極低。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽性反應(yīng)，則計(jì)算金錢白花蛇的拷貝數(shù)，根據(jù)拷貝數(shù)差異鑒別鮮、干金錢白花蛇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鮮、干金錢白花蛇的分子鑒別方法。

背景技術(shù)

鮮藥的應(yīng)用在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上有著悠久的歷史，是中醫(yī)中藥的重要組成部分。鮮藥能最大限度的保留活性成分而發(fā)揮著獨(dú)特的療效，廣受中國古代醫(yī)家的青睞，在中醫(yī)藥古籍中記載著大量鮮藥的應(yīng)用，如《本草綱目》中就記載了1100多條應(yīng)用鮮藥的附方，為后人留下了寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn)。現(xiàn)代化學(xué)及藥理研究發(fā)現(xiàn)，鮮、干藥在物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理活性上存在著差異，在這個(gè)基礎(chǔ)上，一些鮮藥制劑得到了開發(fā)。國內(nèi)外均有鮮藥制劑，國內(nèi)的鮮藥制劑的研究目前處于起步階段，已經(jīng)開發(fā)出來的鮮藥制劑有金龍膠囊、金水鮮膠囊、鮮益母草膠囊等。鮮藥制劑在得到開發(fā)的同時(shí)，其在質(zhì)量控制方面還存在一定缺陷，其中之一就是投料中鮮、干藥材的鑒別問題。

相對(duì)于鮮藥，干藥在儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)确矫娓奖悖页杀靖汀？赡艽嬖谥怎r藥入藥為噱頭，實(shí)際上以干藥入藥的現(xiàn)象。而且藥材市場(chǎng)混亂，出現(xiàn)的偽品及混偽品眾多，質(zhì)量問題嚴(yán)重。目前，中藥及中成藥常用的質(zhì)量控制方法主要有顯微法、光譜法、色譜法等，然而這類方法主要應(yīng)用于具有明確化學(xué)成分的植物藥。與植物藥相比，動(dòng)物藥化學(xué)成分差異大，基礎(chǔ)研究薄弱，只有極少部分動(dòng)物藥具有專屬性鑒別成分，導(dǎo)致此類質(zhì)量控制方法往往缺乏專屬性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)比較落后，多以性狀和雜質(zhì)檢查為主，鑒別方法往往缺乏專屬性，含量測(cè)定項(xiàng)多缺乏或指標(biāo)欠合理。綜上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是指標(biāo)成分的專屬性不高，不足以達(dá)到物種特異性鑒別，而且鮮、干藥材，以及以鮮藥投料的中成藥與以干藥投料的中成藥的鑒別方面，暫無報(bào)道。如《中國藥典》中收載的鮮地黃和鮮益母草；兩者均無其它鑒別指標(biāo)，沒有單獨(dú)就鮮藥規(guī)定化學(xué)成分指標(biāo)。查閱文獻(xiàn)，亦無相關(guān)報(bào)道。

金龍膠囊是由鮮守宮、鮮蘄蛇、鮮金錢白花蛇為原料制成的中成藥，用于癌癥的輔助治療，有人就鮮、干藥入藥向金龍膠囊生產(chǎn)廠家提出質(zhì)疑，為回應(yīng)質(zhì)疑，保證臨床療效和用藥安全，進(jìn)一步提高產(chǎn)品的可信度，建立一種專屬性強(qiáng)且適合鮮、干藥材的鑒別方法是非常有必要的。

鮮金錢白花蛇來源于眼鏡蛇科動(dòng)物銀環(huán)蛇Bungarus multicinctus Blyth的幼體，作為金龍膠囊的主要成分，發(fā)揮著重要的作用。并且由于金錢白花蛇價(jià)格昂貴，在市場(chǎng)中常有偽品出現(xiàn)，如赤鏈蛇、黃鏈蛇、鉛色水蛇、百花錦蛇等，嚴(yán)重影響用藥安全。本發(fā)明運(yùn)用熒光定量PCR法，測(cè)定了鮮、干金錢白花蛇藥材中物種特異性片段的拷貝數(shù)差異，建立了同時(shí)確定金錢白花蛇真?zhèn)魏王r、干的方法和標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述背景技術(shù)中所提出的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鮮、干金錢白花蛇的分子鑒別方法。本發(fā)明提出的分子定量方法，可以通過特異片段拷貝數(shù)的差異鑒別鮮、干藥。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種金錢白花蛇的分子鑒別方法，提取待測(cè)樣品的基因組DNA，用提取的基因組DNA作為模板，利用特異引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；若熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽性反應(yīng)，出現(xiàn)特異性的S形熒光擴(kuò)增曲線且Cq值為11.72-30.74的即為金錢白花蛇；若熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性反應(yīng)，未見特異性的熒光擴(kuò)增曲線或出現(xiàn)熒光值增長且Cq值大于30.74的即為混偽品或金錢白花蛇含量極低。

進(jìn)一步地，所述熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為：DNA模板2μL；上下游引物(即特異引物)各0.4μL，終濃度為200nmol/L；探針Bmpro 0.2uL，終濃度為100nmol/L；Bester qPCRMasterMix 10μL；去離子水7μL，反應(yīng)總體積為20μL。