[發明專利]一種重組蛋白油乳劑亞單位疫苗的破乳方法

在審

• 申請號: 202010126855.4
• 申請日: 2020-02-28
• 公開（公告）號: CN111228859A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 單學強;張倫;于澤坤;欒志舫;只勇;郝光恩;楊海明;段笑笑
• 申請（專利權）人: 山東信得科技股份有限公司;青島信得藥業有限公司
• 主分類號: B01D17/04
• 分類號: B01D17/04;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明是提供一種重組抗原蛋白亞單位疫苗的破乳方法，是將使用油乳劑作為佐劑的亞單位疫苗在冰浴上進行超聲破乳；其中超聲破乳，一種具體條件如下：1000?2500焦耳，超聲2?5秒，停止2?5秒，共30?45個循環，超聲結束后在室溫條件下離心獲得水相。本發明的方法簡便、迅速，可在10分鐘內完成；抗原分離效果好，同時可保證法氏囊病毒VP2蛋白的穩定性；破乳后分離出的水相中的VP2抗原含量可以采用瓊脂擴散試驗法進行檢測；破乳后水相中抗原回收率高，達40％。適用于對marcol52佐劑乳化的雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗和其他基因工程亞單位疫苗進行破乳，進而對水相進行內毒素含量檢測，從而評價成品疫苗的內毒素含量。

技術領域

本發明屬于疫苗質量檢測技術領域，具體為一種基因工程亞單位油乳劑滅活疫苗的破乳方法。

背景技術

傳染性法氏囊病發病率高且病程短，傳播迅速，病雞嚴重腹瀉、極度虛弱并有不同程度死亡，雛雞感染后還可導致免疫抑制，并可誘發多種疫病或導致疫苗免疫失敗。各品種的雞均能感染，潛伏期2～3天。主要發生于2～15周齡的雞，以3～6周齡為發病高峰期，近年來，該病發病日齡有增寬的趨勢，從10日齡至產蛋的雞群均有發生本病的報道。典型發病雞群病初可見個別雞突然發病，精神沉郁，食欲減退，羽毛蓬松，翅下垂，閉目，1～2天內可波及全群。病雞腹瀉，排出白色稀糞，隨著病情的發展，病雞出現畏寒、扎堆，嚴重者垂頭、臥地不起，極度虛弱直至死亡。非典型病例主要見于老疫區或有一定免疫力的雞群，癥狀不典型，主要引起免疫抑制，病雞多出現食欲不振、進行性消瘦和腹瀉等癥狀。傳染性法氏囊病病毒屬RNA病毒，病毒顆粒為球形，無囊膜，核衣殼為二十面體立體對稱，直徑為55～65納米，其基因組由兩個片段的雙股RNA構成。該病毒有5種衣殼蛋白，即VP1～VP5，其中VP2是病毒的主要保護性抗原。

傳染性法氏囊病給家禽業造成巨大的經濟損失，目前尚無特效藥可以治療，主要應用疫苗進行預防，所用疫苗主要為滅活疫苗和凍干活疫苗以及新型的基因工程亞單位疫苗。中等毒力活疫苗雖然能夠抵抗IBDV超強毒株的攻擊,但會對雞的法氏囊產生一定的損傷。另外,使用活疫苗還存在病毒重組和毒力返強的風險。利用大腸桿菌表達系統進行外源蛋白的表達具有明顯的優點，如操作方便簡捷，成本低，易于工業批量生產，生長周期短，自身背景蛋白清晰。基因工程亞單位疫苗具有較好的免疫原性，副作用相對較小。因此安全、高效、可靠、廉價的基因工程亞單位疫苗成為應用前景廣闊的傳染性法氏囊病疫苗。

內毒素存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁的外層，主要成分為脂多糖。當細菌處在生活狀態時，它與菌體結合在一起不被釋放，只有當細菌死亡、自溶或人為破壞時(如凍融、加熱、超聲波作用或藥物浸提)，才能釋放到環境中。一方面，它可以引起機體發熱、白細胞增多，甚至休克死亡；另一方面，具有佐劑作用，可誘導多種細胞因子的表達，使機體非特異性免疫反應增強，從而提高免疫效果。

大腸桿菌工程菌液需經破碎，VP2蛋白才完全釋放出來，破碎后內毒素含量很高，大量的內毒素隨著疫苗注射進入雞的體內對雞是不安全的，會引起注射局部的炎癥反應，產生結節，且影響疫苗吸收，所以生產的VP2蛋白半成品需要經過特定的生產工藝去除大部分內毒素后才能用于疫苗生產。國內常用的雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位油乳劑滅活疫苗的制作過程是將滅活的病毒蛋白與佐劑(常用marcol52佐劑)混合制成油包水劑型疫苗。為客觀的反映產品質量，需要對成品進行內毒素檢測，即將油乳劑滅活疫苗破乳后取水相進行細菌內毒素含量測定。

目前已有使用三氯甲烷法進行疫苗破乳的文獻報道，即將被檢油乳劑疫苗與三氯甲烷等量混合，置微型漩渦振蕩器震蕩后，再以離心收取析出的水相。但是該法由于在破乳過程中向油乳劑疫苗中添加了有機溶劑三氯甲烷，致使破乳后析出的水相中殘留有機溶劑三氯甲烷，會導致檢測水相中內毒素含量時的制備的供試品陽性對照不成立，不能檢測出破乳后水相中內毒素含量的范圍值。所以需要尋找一種簡便、快速并且不影響水相中內毒素含量檢測的破乳方法。

發明內容