[發明專利]一種小牛皺胃凝乳酶及基因與菌株和應用

有效

• 申請號: 202010124633.9
• 申請日: 2020-02-27
• 公開（公告）號: CN111172139B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 楊江科;張柳群;劉桂子
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;A23C9/12;C12R1/84
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
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本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種小牛皺胃凝乳酶及基因與菌株和應用。本發明的凝乳酶BoCHY的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發明所述凝乳酶BoCHY為在小牛皺胃凝乳酶Chy的基礎上通過人工定向改造而來，具有顯著提高的活性和表達水平。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，更具體地，涉及一種小牛皺胃凝乳酶及編碼基因、重組表達載體、重組表達菌株，以及它們的制備方法和應用。

背景技術

凝乳酶是可使乳液凝結的一類酶的總稱。主要應用于乳酪的制作中。完全意義上的凝乳酶最早在小牛皺胃中發現。它是一種天冬氨酸蛋白酶，可專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束結構并形成穩定的副κ-酪蛋白及親水性糖肽。當κ-酪蛋白被水解后，在鈣離子存在下通過κ-酪蛋白分子膠束表面亞基之間以疏水鍵和膠體磷酸鈣相互作用的方式連接在一起而形成乳液的凝固體。凝乳酶是乳酪生產必須的酶種，被廣泛地應用于奶酪和酸奶的制作，在乳制品用酶中占首要地位，其產值約占整個酶制劑總產值的15.0％。

傳統上，凝乳酶專指來源于未斷奶小牛皺胃粘膜的一種蛋白酶。但由于乳制品行業對凝乳酶的需求量巨大，而資源又極為缺乏，因此，其它來源的且能使乳液凝結的蛋白酶均可稱為凝乳酶。目前，凝乳酶的主要來源有：①動物源凝乳酶。凝乳酶最早來源于小牛的第四胃黏膜；②植物源凝乳酶。多種植物中均含有能使乳液凝固的蛋白酶。常見的有：木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等；③微生物源凝乳酶。目前已發現有40余種微生物可生產一定活力的凝乳蛋白酶，主要來自真菌、放線菌、細菌等。

盡管不同來源的凝乳酶都具有使乳液凝固的作用，但在實際的乳酪生產應用過程，經典意義的小牛皺胃凝乳酶仍然是首選品種。它具有專一性強的特征，酪蛋白水解產物中沒有呈苦味的氨基酸產生。其它來源的蛋白酶對酪蛋白的水解產物專一性不強，水解產生的苦味氨基酸含量高，影響乳酪的風味。因此，小牛胃凝乳酶仍是首選的凝乳酶品種。

采用基因工程手段，獲得高活性、高產的凝乳酶生產菌株是獲得可滿足應用需求的、經濟的小牛皺胃凝乳酶的主要方式。國際上，小牛皺胃凝乳酶基因已經在大腸桿菌(Escherichia coli)和乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)中高效表達，并已經實現了產業化。但由于E.coli潛在的生物安全性，K.lactis等產量相對較低等原因，還需要從新的途徑獲得更高效、更高產的小牛皺胃凝乳酶及生產菌株。

畢赤酵母真核表達系統是目前廣泛使用的真核生物表達系統，它具有生物安全性高、高密度發酵工藝成熟、生產技術配套等優點，是凝乳酶工業化生產的理想菌株。然而，由于受到畢赤酵母對異源基因密碼子使用偏好性等因素的影響，來源于小牛皺胃的凝乳酶往往不會高效表達。因此，對小牛皺胃凝乳酶進行設計和改造，提高它的活性和表達量；通過異源基因的密碼子依據畢赤酵母的偏好性進行優化等方式進一步提高其產量，獲取高活性、高產菌株具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種高活性、高產的小牛皺胃凝乳酶及基因、重組表達載體、高產菌株，以及它們的制備方法，旨在為小牛皺胃凝乳酶的產業化及應用奠定基礎。

為了實現上述目的，本發明提供一種小牛皺胃凝乳酶BoCHY，所述凝乳酶BoCHY的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。