[發(fā)明專利]一種基于RAA熒光法快速檢測(cè)流感病毒H5N1的引物、探針及檢測(cè)試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010123015.2
• 申請(qǐng)日: 2020-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN111455097A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭偉;鮑澤英;王玲;鄭樂怡;陳淑丹;吳忠華;郭利川;湯賽君;王智宏;應(yīng)清界
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州國際旅行衛(wèi)生保健中心（杭州海關(guān)口岸門診部）;江蘇奇天基因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發(fā)明提供一種基于RAA熒光法檢測(cè)流感病毒H5N1的引物、探針及檢測(cè)試劑盒，所述引物和探針適用于RAA熒光法檢測(cè)，并且能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出流感病毒H5N1，特異性能夠達(dá)到100％，所述檢測(cè)試劑盒能夠方便快速且準(zhǔn)確地鑒定流感病毒H5N1，操作方便，檢測(cè)時(shí)間短，15min內(nèi)可以完成檢測(cè)，無需像PCR一樣通過高溫95℃變性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30～42℃下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增即可完成檢測(cè)。也無需像LAMP技術(shù)一樣使用4?6條引物在65℃情況下進(jìn)行擴(kuò)增且容易產(chǎn)生假陽性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于RAA熒光法快速檢測(cè)流感病毒H5N1的引物、探針及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

流行性感冒(流感)是一種由流行性感冒病毒引起的季節(jié)性急性上呼吸道感染疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)不完全統(tǒng)計(jì),平均每年全世界約有三百萬到五百萬人感染流感病毒,其中約有五十萬人死于流感病毒。

流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱流感病毒,是一種RNA病毒,呈球形或絲狀,直徑80～120nm,分為A(甲)、B(乙)、C(丙)三型,這三型具有相似的生化和生物學(xué)特征。流感病毒有一層脂質(zhì)囊膜，膜上有蛋白質(zhì),是由凝血素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)組成,均具抗原性,易發(fā)生變異。A型流感病毒主要有H和N變異,H有16個(gè)亞型,N有9個(gè)亞型,因此A型流感病毒又分很多亞型。A型流感病毒是引起人畜流感的主要病毒,且經(jīng)常發(fā)生抗原變異,傳染性大,傳播迅速,極易發(fā)生大范圍流行。例如,2009年4月,美國和墨西哥爆發(fā)甲型H1N1流感,繼而造成全球的大流行,威脅及干擾到全世界人民的健康及生活質(zhì)量。B型流感病毒變異性較柔弱,不再分亞型,一般引起局部流行。C型流感病毒的抗原性比較穩(wěn)定,通常不會(huì)引起嚴(yán)重的疾病,可以散發(fā)出現(xiàn)。臨床上絕大多數(shù)病例是由A型或B型流感病毒引起的。C型流感病毒只引起輕度的上呼吸道疾病。

禽流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類感染疾病。禽流感病毒血清型眾多，變異性極強(qiáng)，高致病性毒株發(fā)病率和致死率可高達(dá)100％，一些低致病力毒株在短期內(nèi)可變異成高致病性毒株，給養(yǎng)禽業(yè)及相關(guān)行業(yè)帶來了毀滅性打擊，對(duì)動(dòng)物衛(wèi)生、食品安全、人類健康和國家經(jīng)濟(jì)安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此防治禽流感具有重要的公共衛(wèi)生意義，已成為世界各國人畜共患病監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。

為有效減少禽流感的發(fā)生率，迫切需要建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)流感病毒的方法,這對(duì)于流感患者的臨床診斷和及時(shí)有效的治療具有重大的意義,對(duì)全球的流感流行趨勢(shì)起到預(yù)見性的作用。目前診斷呼吸道腺病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括病毒分離培養(yǎng)法檢測(cè)、血清學(xué)診斷、血清抗體檢測(cè)及分子生物學(xué)方法檢測(cè)。

病毒分離培養(yǎng)是鑒定病毒的經(jīng)典方法,包括傳統(tǒng)病毒分離培養(yǎng)和快速病毒分離培養(yǎng)。傳統(tǒng)的流感病毒分離培養(yǎng)主要包括流感病毒雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。具體操作方法是采樣之后接種雞胚或犬腎細(xì)胞，培養(yǎng)數(shù)天后再通過觀察血細(xì)胞吸附情況判斷有無流感病毒的存在。若有流感病毒存在,可通過免疫熒光來鑒別流感病毒的分型。傳統(tǒng)流感病毒培養(yǎng)通常需要約2-14。

免疫熒光技術(shù)不僅可用于細(xì)胞培養(yǎng)中病毒的鑒定，也可用于臨床標(biāo)本中病毒抗原的檢測(cè)，具有快速簡(jiǎn)便、特異性高的特點(diǎn)，但是其敏感性較低。

分子生物學(xué)方法如實(shí)時(shí)熒光PCR具有靈敏度，特性好，但需要專業(yè)技術(shù)人員和復(fù)雜的儀器和完備的實(shí)驗(yàn)室，時(shí)間周期也需要1.5-2小時(shí)；逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)具有等溫60-65℃，具有很好的特異性，但假陽性率較高，引物設(shè)計(jì)復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容