[發明專利]一種微生物快速定性定量的試劑盒以及快速定性定量的方法

有效

• 申請號: 202010122928.2
• 申請日: 2020-02-27
• 公開（公告）號: CN111257559B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 吳薇;楊慶利
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12Q1/689;C12Q1/10;C12R1/93;C12R1/42
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 肖太升;高洋

1.一種微生物快速定性定量的試劑盒，其特征在于，包含定量反應體系和定性反應體系；所述定性反應體系包含蛋白A磁珠、抗體B、磁架、HRP-二抗、洗脫液；

定量反應體系包含蛋白A磁珠、抗體B、磁架、洗脫液、RNA提取試劑、聚合酶、反轉錄酶、擴增緩沖液、dNTPs、擴增引物；

所述蛋白A為微生物靶向人體細胞的受體蛋白；

所述抗體B為特異性識別結合微生物表面外殼蛋白的IgG抗體；

所述蛋白A和抗體B與待檢測微生物特異性結合形成三元復合體；

使用方法為：

(1)向待測溶液中加入蛋白A-磁珠和抗體B，混合孵育，使抗體B和磁珠上的蛋白A特異性結合在待微生物上；分離蛋白A-磁珠/微生物/抗體B的復合物；

(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗體B的復合物中加入特異性識別結合抗體B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通過觀察顏色變化，實現微生物的定性檢測；

(3)將步驟2)定性檢測陽性的蛋白A-磁珠/微生物/抗體B復合物進行RT-PCR擴增，對微生物進行定量分析。

2.根據權利要求1所述微生物快速定性定量的試劑盒，其特征在于，所述的蛋白A磁珠由以下方法制備而成：

稱取200mg蛋白A，169.31mg?EDC和47.98mg?NHSS，分別溶于無菌的PBS溶液中，然后混合通過碳化二亞胺法，活化蛋白A，活化10min；將活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修飾的磁珠中，孵育6h；反應完畢后，用無菌的PBS洗滌3次，重懸于10mL無菌的PBS溶液中，即得濃度為20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。

3.權利要求2所述微生物快速定性定量的試劑盒，其特征在于，所述的磁珠為四氧化三鐵磁珠。

4.根據權利要求1～3任一項所述微生物快速定性定量的試劑盒，其特征在于，所述微生物為食源性致病菌、冠狀病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一種。

5.一種微生物快速定性定量的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)向待測溶液中加入蛋白A-磁珠和抗體B，混合孵育，使抗體B和磁珠上的蛋白A特異性結合在待微生物上；分離蛋白A-磁珠/微生物/抗體B的復合物；

(2)蛋白A-磁珠/微生物/抗體B的復合物中加入特異性識別結合抗體B的HRP-二抗，再加入HRP的催化底物，通過觀察顏色變化，實現微生物的定性檢測；

(3)將步驟2)定性檢測陽性的蛋白A-磁珠/微生物/抗體B復合物進行RT-PCR擴增，對微生物進行定量分析；

所述蛋白A為微生物靶向人體細胞的受體蛋白；

所述抗體B為特異性識別結合微生物表面外殼蛋白的IgG抗體。

6.根據權利要求5所述微生物快速定性定量的方法，其特征在于，所述的蛋白A磁珠由以下方法制備而成：

稱取200mg蛋白A，169.31mg?EDC和47.98mg?NHSS，分別溶于無菌的PBS溶液中，然后混合通過碳化二亞胺法，活化蛋白A，活化10min；將活化后的蛋白A加入到牛血清白蛋白修飾的磁珠中，孵育6h；反應完畢后，用無菌的PBS洗滌3次，重懸于10mL無菌的PBS溶液中，即得濃度為20mg/mL的蛋白A包裹磁珠。

7.權利要求6所述微生物快速定性定量的方法，其特征在于，所述的磁珠為四氧化三鐵磁珠。

8.根據權利要求5～7任一項所述微生物快速定性定量的方法，其特征在于，所述微生物為食源性致病菌、冠狀病毒、流感病毒、乙肝病毒中的任意一種。