[發明專利]一種利用基因編輯精準創制小麥waxy基因突變體材料的方法

在審

• 申請號: 202010119309.8
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111286514A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 李根英;李玉蓮;張淑娟;高潔;張榮志;宋國琦;李瑋;陳明麗;劉敏;李吉虎
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/54;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

1.一種具有敲除waxy基因功能的pBUE411-waxy雙元載體，其特征在于，包括表達盒A和表達盒B；

所述表達盒A具體自上游至下游依次包括如下元件：所述來自小麥的TaU3啟動子A，所述waxy基因的sgRNA、終止子A；

所述表達盒B具體自上游至下游依次包括如下元件：所述啟動子B、所述玉米Cas9編碼序列、所述終止子B；

所述waxy基因的sgRNA的序列如SEQ10所示；

所述啟動子A的序列如SEQ3所示；

所述啟動子B序列如SEQ4所示；

所述終止子A序列如SEQ5所示；

所述終止子B序列如SEQ6所示。

2.如權利要求1所述的pBUE411-waxy雙元載體，其特征在于，所述表達盒A具體可如序列SEQ7所示；

所述表達盒B具體可如序列SEQ8所示；

所述表達盒A位于所述表達盒B的上游，表達盒A和表達盒B相互串聯。

3.如權利要求1 2所述的pBUE411-waxy雙元載體，其特征在于，所述pBUE411-waxy雙元載體含有抗性標記基因，所述抗性標記基因是bar基因；

所述pBUE411-waxy雙元載體的核苷酸序列如SEQ9所示。

4.如權利要求1或2所述的pBUE411-waxy雙元載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S11：根據靶向Waxy基因設計其sgRNA，sgRNA的寡核苷酸對應的是waxy-gR1-TaU3-F和waxy-gR1-TaU3-R，即waxy-gR1-TaU3-F序列如SEQ1所示，waxy-gR1-TaU3-R序列如SEQ2所示；

S12：將步驟S11合成的sgRNA的2條oligo進行磷酸化和退火形成雙鏈，獲得帶有粘性末端的雙鏈sgRNA；

S13：利用限制性內切酶BsaI酶切pBUE411載體，利用限制性內切酶BsaI酶切pBUE411載體，回收含有所述啟動子A、所述終止子A的載體片段；利用限制性內切酶BsaI酶切pBUE411載體，回收含有所述啟動子B、所述終止子B的載體片段；

S14：將步驟S13回收的pBUE411載體片段和步驟S12獲得的雙鏈sgRNA進行通過T4連接酶進行連接反應，獲得最終的pBUE411-waxy雙元載體。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述Waxy基因可為GENBANK ACCESSIONNUMBER：KF007194.1所示的DNA。

6.含有如權利要求1-3任一項所述的pBUE411-waxy雙元載體的轉基因細胞系或重組菌。

7.如權利要求1-3任一項所述的pBUE411-waxy雙元載體在降低小麥胚乳中waxy基因表達水平的應用。

8.如權利要求1-3任一項所述的pBUE411-waxy雙元載體在小麥淀粉改良中的應用。

9.如權利要求1-3任一項所述的pBUE411-waxy雙元載體在培育轉基因小麥中的應用。

10.一種利用基因編輯精準創制小麥waxy基因突變體材料的方法，包括如下步驟：

S1構建一種如權利要求1-3任一項所述的pBUE411-waxy雙元載體；

S2將步驟S1獲得的pBUE411-waxy雙元載體通過農桿菌轉化到普通小麥中，獲得轉基因小麥。