[發明專利]用于檢測重組人神經生長因子基因拷貝數的方法及引物

在審

• 申請號: 202010119056.4
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111206075A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 趙澤坤;邵軍超;史權威
• 申請（專利權）人: 北京華安科創生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

本發明涉及基因檢測技術領域，具體涉及用于檢測重組人神經生長因子基因拷貝數的方法及引物。所述引物包括序列表中序列1和序列2所示的引物對。所述方法采用所述引物對細胞樣品中的目的基因進行熒光定量PCR，同時對內參基因進行熒光定量PCR，將各自的Cq值分別代入各自的標準曲線中，得到目的基因拷貝數和內參基因拷貝數，目的基因拷貝數/內參基因拷貝數即為樣品中重組人神經生長因子基因拷貝數。該方法特異性強、靈敏度高、簡便快速，有助于評估細胞庫在傳代過程中重組人神經生長因子基因的穩定性。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，特別是涉及一種用于檢測細胞中重組人神經生長因子(NGF)基因拷貝數的方法及引物。

背景技術

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是最早發現的神經營養因子，其在神經細胞的生長、發育、分化、存活和損傷神經修復中起著重要的作用。目前，臨床采用鼠頜下腺提取的NGF用于各類神經損傷的修復，療效顯著。由中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)表達的重組人神經生長因子(rhNGF)相較于鼠神經生長因子(mNGF)具有活性更高、免疫風險更低的特點，具有廣闊的市場前景。

中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞主要用于重組蛋白的表達。1984年，Genentech公司首次實現重組中國倉鼠卵巢細胞表達組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，t-PA)，標志著哺乳動物細胞表達系統的建立。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉染到哺乳動物細胞，一些有價值的蛋白不斷實現表達，包括凝血因子、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、免疫球蛋白、尿激酶(urokinase，UK)、乙肝表面抗原(HBsAg)和單克隆抗體等。

利用CHO細胞重組表達NGF，需首先通過基因轉染技術，將NGF基因整合到CHO細胞的染色體上，這是NGF蛋白質得以穩定表達的前提，這種基因的整合可能是單拷貝或多拷貝的，而基因整合的拷貝數將影響NGF重組蛋白的表達，為此有必要對NGF基因的整合效率進行檢測，也就是對插入的NGF基因的拷貝數進行檢測。同時，由于含有NGF基因的CHO表達細胞在傳代的過程中，會出現不穩定的現象，有可能在傳代的過程中出現目的基因丟失的情況。因此在細胞庫傳代的過程中，NGF基因拷貝數是一個重要的參數。

為了從分子水平考查細胞株的穩定性，目前常采用Southern blot、實時定量PCR等方法檢測外源基因拷貝數。Southern blot法步驟較繁瑣，而實時定量PCR法操作簡便，DNA樣品用量少，可快速準確地檢測基因組的拷貝數。目前尚無針對CHO細胞中NGF基因拷貝數熒光定量PCR的檢測方法。

發明內容

為彌補上述領域存在的不足，本發明提供用于檢測細胞中重組人神經生長因子(NGF)基因拷貝數的方法和引物。該方法具有檢測準確，靈敏度高、特異性強、簡便快速等優點，有助于評估細胞庫(例如CHO細胞庫)在傳代過程中NGF基因的穩定性。

一方面，本發明提供用于檢測細胞中重組人神經生長因子基因拷貝數的引物對，其包括序列表中序列1和序列2所示的引物對。

在本發明的一些實施例中，所述細胞為中國倉鼠卵巢細胞；所述引物對還包括序列表中序列3和序列4所示的引物對。

上述引物對在檢測中國倉鼠卵巢細胞中重組人神經生長因子基因拷貝數中的應用也屬于本發明的保護范圍。

另一方面，本發明提供用于檢測細胞中重組人神經生長因子基因拷貝數的方法，包括如下步驟：