[發(fā)明專利]一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010116927.7
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111206018A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設計）人: 張清淋;占強;聶賀;安方梅
• 申請（專利權）人: 無錫市人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P1/16
• 代理公司: 北京華際知識產(chǎn)權代理有限公司 11676
• 代理人: 張文杰

1.一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)骨髓間充質(zhì)干細胞的分離；

2)傳代培養(yǎng)，得到傳代間充質(zhì)干細胞；

3)選取傳代間充質(zhì)干細胞，應用含有IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到IL-1β預處理的間充質(zhì)干細胞。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟3)中，選取傳代間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞融合度達到60％-70％，更換為含有20ng/mL的IL-1β培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，得到IL-1β預處理的間充質(zhì)干細胞。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟2)操作時，選取步驟1)分離得到的骨髓間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞融合度達70％時進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3-5代后得到傳代間充質(zhì)干細胞。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述骨髓間充質(zhì)干細胞來源為大鼠骨髓。

5.根據(jù)權利要求4所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟1)中，骨髓間充質(zhì)干細胞的分離方法為全骨髓貼壁法。

6.根據(jù)權利要求5所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟1)中，具體操作步驟為：

a)選取大鼠，麻醉處死，無菌分離大鼠股骨，以無菌PBS沖洗骨髓腔，收集骨髓并打散后接種于含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；

b)培養(yǎng)72h后更換培養(yǎng)基，并除去未貼壁細胞，后每3天換液1次，得到骨髓間充質(zhì)干細胞。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟2)得到傳代間充質(zhì)干細胞后進行細胞鑒定。

8.根據(jù)權利要求7所述的一種用于治療急性肝衰竭的間充質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于：步驟2)中，細胞鑒定步驟包括：

a)通過倒置顯微鏡觀察傳代間充質(zhì)干細胞的形態(tài)與生長特點；

b)選取傳代間充質(zhì)干細胞，采用流式細胞儀檢測陽性表面標志物CD90、CD105及陰性標志物CD45、CD34的表達；

c)選取傳代間充質(zhì)干細胞，體外誘導法誘導成脂、成骨分化，誘導2周后，分別通過油紅O染色、茜素紅染色鑒定。

9.按權利要求1-8中任意一項所述的IL-1β預處理的間充質(zhì)干細胞的應用，其特征在于：所述IL-1β預處理的間充質(zhì)干細胞在急性肝衰竭治療中的應用。

10.按權利要求9所述的IL-1β預處理的間充質(zhì)干細胞的應用，其特征在于：IL-1β預處理的間充質(zhì)干細胞用于急性肝衰竭治療時，靜脈注射1×10⁷細胞/kg間充質(zhì)干細胞。