[發明專利]rhTSG-6在雞胚-H2N9亞型禽流感病毒血凝體系上抗病毒活性的檢測方法與應用

在審

• 申請號: 202010116906.5
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111228463A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 王明麗;蔣敏之;吳博;何志遠;周煒;夏兵兵
• 申請（專利權）人: 蕪湖天明生物技術有限公司
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61P31/16;C12Q1/02;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 尹婷婷

本發明提供了rhTSG?6在雞胚?H2N9亞型禽流感病毒血凝體系上抗病毒活性的檢測方法與應用，該方法對觀察與檢測rhTSG?6抗病毒活性結果顯示，其可抑制雞胚尿囊中H2N9亞型禽流感病毒的增殖復制，發生了血凝現象降低或全無現象。以此為評價結果的標準，可使不同批次測定的rhTSG?6蛋白效價檢測結果更為可靠可信；該方法結果明確，重復性及準確度均高；經本方法驗證，rhTSG?6抗H2N9亞型禽流感病毒的效價高達100000.00U/mL以上。填補了相關領域空白。

技術領域

本發明屬于微生物學與免疫學領域，具體涉及rhTSG-6在雞胚-H2N9亞型禽流感病毒血凝體系上抗病毒活性的檢測方法與應用。

背景技術

腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-α stimulated gene 6，TSG-6)是一種炎癥相關的分泌性蛋白。大量研究表明，TSG-6是一種效果明顯的抗炎因子，在肝炎、關節炎、視網膜炎、組織損傷、瘢痕疙瘩等炎癥過程中，TSG-6均能夠抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達，并且具有抑制中性粒細胞浸潤等功能，發揮較強的抗炎作用。在機體遭受感染、創傷等侵害時，適度的炎癥反應會有利于機體清除病原體，修復損傷。雖然TSG-6的研究及其生物學功能得到日益重視，但至今尚未見到該重組蛋白在雞胚-H2N9亞型禽流感病毒血凝試驗模型體系上檢測其具有抗病毒活性等報告。本發明首次發現，重組人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在體內外均具有抗病毒活性，填補了此領域的空白。

發明內容

本發明公開了rhTSG-6在雞胚-H2N9亞型禽流感病毒血凝體系上抗病毒活性的檢測方法與應用，H9N2亞型禽流感病毒主要通過其表面的血凝素蛋白感染宿主易感細胞；而血凝素蛋白可以與脊椎動物紅細胞表面的唾液酸受體結合，從而使紅細胞之間發生凝集，此現象稱為血凝反應(hemagglutination assay，HA)。當與一定量的特異性抗體與病毒預先處理后，病毒表面的血凝素蛋白被特異的抗體封閉，便失去HA活性，此種現象稱之為血凝抑制(hemagglutination inhibition assay，HI)現象。

依據此原理，本發明發現，rhTSG-6在雞胚-H2N9亞型禽流感病毒血凝體系上具有與特異性抗體類似的抗病毒活性現象，即能抑制H9N2亞型禽流感病毒在雞胚尿囊中的復制增殖。此活性可以一定量的rhTSG-6能使H9N2亞型禽流感病毒血凝現象被抑制的程度(半數抑制或全抑制)作為檢測其活性的結果，即以每毫升rhTSG-6檢品的最高稀釋度仍能保護半數雞胚(50％)免受病毒的攻擊使之出現HI現象的稀釋度的倒數定為rhTSG-6單位(或稱效價)，常以單位(U)表示。該結果經HI現象觀察后，按Reed-Muench公式計算出所測rhTSG-6抗病毒活性的效價，約為1.0×10³U～1.0×10⁵U/mL/mL；通過Spss16.0對各組雞胚尿囊液中被抑制病毒增殖的數據進行統計分析，結果如圖5所示。從圖5中可以看出，相比病毒對照組和陰性對照組，rhTSG-6各組的HA效價有明顯下降，隨著rhTSG-6濃度下降，HA效價下降幅度隨之降低，則判斷rhTSG-6具有明顯抗病毒效果，同時低劑量組、中劑量、較高劑量和高劑量組均表現出非常顯著的抑制病毒增殖效力(p0.01)。該方法能準確客觀地觀察與檢測rhTSG-6抗病毒活性，填補了相關領域空白。

本發明采取的技術方案為：

本發明提供了重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白6在抗H9N2亞型禽流感病毒藥物中的應用。通過雞胚/H9N2亞型禽流感病毒血凝體系，rhTSG-6能有效抑制H9N2亞型禽流感病毒在雞胚中的增殖，可明顯降低雞胚尿囊液中H9N2病毒的血凝效價。驗證了rhTSG-6具有抗病毒的作用。

本法還提供了一種檢測重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白6抗病毒活性的血凝抑制體系，所述血凝抑制體系為重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白6/雞胚/H9N2亞型禽流感病毒血凝抑制體系。