[發(fā)明專利]一種一管式檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的試劑盒和方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010116817.0
• 申請(qǐng)日: 2020-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN111172253A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱田;李春雨;章澤林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海未凡生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 上海海頌知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31258
• 代理人: 何葆芳

1.一種一管式檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于：包括CYP2C91075A＞C與VKORC1 1639GA聯(lián)合檢測反應(yīng)液；所述CYP2C9 1075A＞C與VKORC1 1639GA聯(lián)合檢測反應(yīng)液包括針對(duì)CYP2C9 1075A＞C位點(diǎn)的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物組及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的探針組，針對(duì)VKORC1 1639GA位點(diǎn)的SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示序列的引物組及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的探針組。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所有探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM、VIC、ROX、CY5中的任意一種，所有探針的3'端均標(biāo)記有淬滅熒光染料BHQ。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：針對(duì)CYP2C9 1075A＞C位點(diǎn)的野生型探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，針對(duì)CYP2C9 1075A＞C位點(diǎn)的突變型探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料VIC，針對(duì)VKORC1 1639GA位點(diǎn)的野生型探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料ROX，針對(duì)VKORC1 1639GA位點(diǎn)的突變型探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料CY5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的CYP2C9 1075A＞C與VKORC11639GA聯(lián)合檢測反應(yīng)液中還包括改良型HotStar Taq酶、直擴(kuò)PCR擴(kuò)增緩沖液、直擴(kuò)試劑和穩(wěn)定劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述直擴(kuò)PCR擴(kuò)增緩沖液的組成為：Tris-HCl緩沖溶液，其中含有200mmol/L～400mmol/L KCl。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述直擴(kuò)試劑的組成為：25mmol/L～50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L～5mmol/L EDTA，200mmol/L～400mmol/L NaCl，0.1wt％～0.6wt％SDS，0.5mol/L～2.0mol/L山梨醇，0.5mmol/L～0.8mmol/L DTT。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述穩(wěn)定劑的組成為：0.5wt％～1.0wt％甘油，0.2wt％～0.6wt％NP40，0.2wt％～0.6wt％tween20，0.5mg/mL～2mg/mLBSA。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，所述陽性對(duì)照品采用人基因組，所述陰性對(duì)照品采用DEPC H₂O。

9.一種一管式檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的方法，其特征在于，包括權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，且所述方法包括如下步驟：

a)取待測樣本直接加入含有CYP2C9 1075A＞C與VKORC1 1639GA聯(lián)合檢測反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，待混勻離心后，再放入熒光定量PCR儀器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性10秒鐘；60℃退火30秒鐘；40個(gè)循環(huán)；

b)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測，并根據(jù)熒光曲線和Ct值直接對(duì)測試樣本的多態(tài)性進(jìn)行判讀。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：PCR反應(yīng)管中的待測樣本量為1μL，聯(lián)合檢測反應(yīng)液為20μL，且聯(lián)合檢測反應(yīng)液中的引物和探針的濃度均為200nmol/L。