[發(fā)明專利]一種酶催化劑及其制備方法與在生產(chǎn)3-氨基丙酸中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010116019.8
• 申請(qǐng)日: 2020-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN111304184A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳可泉;馮嬌;王昕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12P13/04
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 胡建華

本發(fā)明公開了一種酶催化劑及其制備方法與在生產(chǎn)3?氨基丙酸中的應(yīng)用，所述的制備方法包括如下步驟：(1)將L?天冬氨酸脫羧酶菌株培養(yǎng)，離心，得到菌體；(2)用水將步驟(1)得到的菌體重懸，得到重懸液；向重懸液中加入表面活性劑，攪拌，離心，得到上清液；(3)向步驟(2)得到的上清液中加入金屬離子，混合，再加入配體溶液，攪拌，洗滌，離心，所得沉淀物即為酶催化劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明簡(jiǎn)化了從細(xì)胞中提取酶的操作過程，以一種兩步法快速合成的形式制備了納米材料固定化的酶催化劑，制備過程簡(jiǎn)單方便對(duì)設(shè)備需求低；且本發(fā)明對(duì)L?天冬氨酸脫羧酶實(shí)現(xiàn)了可回收和較好的重復(fù)利用率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)屬于及酶催化固定化酶領(lǐng)域，具體涉及一種酶催化劑及其制備方法與在生產(chǎn)3-氨基丙酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

3-氨基丙酸，又稱為β-丙氨酸，作為最具潛力的三碳化合物之一，可以用于合成維生素B5、泛酸鈣、巴柳氮、肌肽、聚-β-丙氨酸等產(chǎn)品，在醫(yī)藥、化工、美容、食品、環(huán)境等方面都有著很廣泛的用途。目前，化學(xué)法合成3-氨基丙酸反應(yīng)過程中大都需要較為苛刻的工藝條件，而且存在著副產(chǎn)物多、環(huán)境污染的問題，使得生物催化法合成3-氨基丙酸受到廣泛的關(guān)注。以L-天冬氨酸作為底物，用全細(xì)胞催化的方式來合成3-氨基丙酸是一種綠色環(huán)保的方式。然而，全細(xì)胞催化的方式存在酶活性低、存在底物產(chǎn)物抑制、耐受性差等問題限制其在3-氨基丙酸生物合成中的應(yīng)用。因此開發(fā)酶法制備3-氨基丙酸是一種更高效的生物催化策略。脫羧酶能夠脫去羧酸分子中的羧基并產(chǎn)生二氧化碳，它包括氨基酸類脫羧酶和有機(jī)酸類脫羧酶。L-天冬氨酸脫羧酶是以L-天冬氨酸為底物的脫羧酶。L-天冬氨酸脫羧酶由panD基因調(diào)控編碼，是一種丙酮酰基依賴酶，能夠催化L-天冬氨酸脫去α位羧基，生成3-氨基丙酸，并且可以合成乙酰輔酶A、泛酸等，是生物體內(nèi)至關(guān)重要的營(yíng)養(yǎng)因子。傳統(tǒng)的制備酶催化劑步驟繁瑣，需要破碎細(xì)胞、分離酶液、純化酶液、固定化酶多步操作過程，耗時(shí)耗力且存在酶活不夠高、底物抑制、產(chǎn)物抑制、生產(chǎn)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，并不適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

金屬-有機(jī)框架材料是由金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體組成的具有超高比表面積、高孔隙率的多孔結(jié)構(gòu)的納米材料。金屬-有機(jī)框架材料可以對(duì)酶進(jìn)行很好的固定化操作，其次合理的金屬離子的選擇使用往往可以激活和提升酶的催化性能，是一類非常理想的固定化酶材料。然而目前的研究表明金屬-有機(jī)框架材料過于堅(jiān)硬的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不利于酶在固定化材料中的進(jìn)行催化。因此通過表面活性劑的修飾作用，優(yōu)化酶的固定化過程，改造固定化過程中的酶吸附過程，提高固定化酶的固載率，使得酶與固定化材料內(nèi)部是一種可行的方法。綜上所述，本研究第一步利用表面活性劑直接破裂微生物細(xì)胞，獲得表面活性劑與酶的混合液，第二步直接在室溫下利用共沉淀法制備得到表面活性劑修飾的金屬-有機(jī)框架固定化的酶催化劑。在簡(jiǎn)化了制備傳統(tǒng)酶催化劑的操作過程，優(yōu)化了酶的固定化吸附過程，進(jìn)而提升了L-天冬氨酸脫羧酶生物催化產(chǎn)3-氨基丙酸的產(chǎn)量和催化性能。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是制備酶催化劑的繁瑣操作過程和金屬-有機(jī)框架材料固定化酶催化劑催化效果可控性差的問題，提供一種固定化全細(xì)胞制備3-氨基丙酸的方法，該方法對(duì)于3-氨基丙酸的產(chǎn)量有了明顯的提升，并且顯著提升了固定化酶催化劑的使用性能。

發(fā)明思路：在收集的微生物細(xì)胞懸液中添加表面活性劑，裂解微生物細(xì)胞細(xì)胞膜，獲得表面活性劑與L-天冬氨酸脫羧酶的混合液，在混合液中利用共沉淀法制備出金屬-有機(jī)框架材料固定化酶催化劑，利用不同金屬離子和表面活性劑對(duì)于酶的促進(jìn)和激活作用，提升L-天冬氨酸脫羧酶的催化活性，利用形成的金屬-有機(jī)框架材料對(duì)酶進(jìn)行保護(hù)作用，提升酶催化劑在生物催化過程中的耐受性和重復(fù)利用率，進(jìn)而提升3-氨基丙酸的產(chǎn)量。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種酶催化劑的制備方法，其包括如下步驟：

(1)將L-天冬氨酸脫羧酶菌株培養(yǎng)，離心，得到菌體；

(2)用水將步驟(1)得到的菌體重懸，得到重懸液；向重懸液中加入表面活性劑，攪拌，離心，得到上清液；