[發明專利]提高載藥囊泡產率的方法

在審

• 申請號: 202010115756.6
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111228221A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 陳彬;孟凡帆;張一
• 申請（專利權）人: 湖北盛齊安生物科技股份有限公司
• 主分類號: A61K9/127
• 分類號: A61K9/127;A61K47/46;A61K31/519;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

本發明提供一種提高載藥囊泡的產率的方法，將細胞囊泡與化療藥物在30～38℃內孵育制備載藥囊泡。其中，在30～38℃范圍內孵育制備的載藥囊泡的產率大于等于40％，在35～37℃范圍內孵育制備的載藥囊泡大于等于60％。經實驗驗證，在30～38℃內孵育制備的載藥囊泡與室溫條件下制備的載藥囊泡在粒徑，含藥量，腫瘤抑制作用等方面均無差異。本發明的方法高效經濟，操作簡單，可在工業生產中大規模應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提高細胞囊泡包裹腫瘤化療藥形成的載藥囊泡產率的方法。

背景技術

細胞囊泡廣泛存在于細胞培養上清以及各種體液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調節等過程。細胞囊泡在多種疾病的早期診斷、作為免疫調節劑、化療藥物載體等方面具有廣闊的臨床應用前景，可以為多種疾病包括腫瘤的早期診斷、治療及預后提供重要的依據。

中國專利CN102302784A公開了一種腫瘤化療藥物制劑及其制備方法，該制劑是以源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡為載體，用其包裹腫瘤化療藥制備而成。該制劑直接到達腫瘤部位，提高了化療藥的藥效，同時克服了因外源載體給藥而對機體產生的毒副作用，作為一種高效的化療藥物載體日益受到研究者的重視，尤其是在制藥領域具備廣闊的應用前景。CN102302784A還公開了所述腫瘤化療藥物制劑的制備方法，其中包括使用紫外線照射腫瘤細胞獲得的細胞囊泡與化療藥的孵育，化療藥以接近該化療藥在作為載體的細胞囊泡中的最大飽和度的量加入到細胞囊泡中，并在室溫條件下進行孵育，實現細胞囊泡對化療藥的包裹；或將添加了化療藥的細胞囊泡體系進行2～4小時的靜置來實現。其中采用室溫孵育的方式制備載藥囊泡的具體操作參見CN102302784A說明書實施例2。

但是，采用室溫孵育的方式制備載藥囊泡，因室溫環境變化較大，囊泡產率不穩定。使得批量生產囊泡產率和質量控制難度加大，不利于工業化生產，從而不能滿足大規模的臨床用藥。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高載藥囊泡的產率的方法，具體的將細胞囊泡與化療藥物在30～38℃溫度范圍內孵育，使所述細胞囊泡包裹所述化療藥物而制得載藥囊泡。其中，所述細胞囊泡通過紫外線照射或化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡而獲得。孵育溫度可選地通過二氧化碳培養箱精準控制。

本發明的一個具體實施方式中，將源自凋亡的腫瘤細胞的細胞囊泡與化療藥孵育制備包裹化療藥的腫瘤細胞囊泡，孵育溫度分別設置為8、15、25、30、37、42、50℃的二氧化碳培養箱進行。實驗結果發現溫度范圍在30～40℃時，載藥囊泡的產率較高。

在此基礎上，對優選的溫度范圍30～40℃進行了進一步細化研究。分別將腫瘤細胞凋亡產生的細胞囊泡與化療藥物的孵育溫度條件設置為30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃。研究發現溫度范圍30～38℃條件下的囊泡產率相對較高，載藥囊泡的產率大于等于40％。進一步地，當孵育溫度為35～37℃時，囊泡產率最高，大于等于60％。

本發明還同時對不同孵育溫度與室溫孵育制備所得同等數目的載藥囊泡在殺傷和抑制腫瘤細胞生長方面的效果進行對比。實驗表明采用30～38℃孵育的方法制備所得的載藥囊泡在維持穩定和高產率的同時，與室溫條件孵育制備的載藥囊泡的相比抗腫瘤功能未發生改變。

本發明還使用不同的靶細胞對于25℃、30℃和38℃孵育制備所得的囊泡進行腫瘤抑制作用檢測，發現與室溫孵育制備所得囊泡在同等數目下對人肺癌系細胞A549、人結腸癌細胞系HCT-8、人肝膽管癌細胞系RBE、人肝癌細胞系SK-HEP-1的殺傷效果相當，體內抑制腹水增殖的效果也無差異，說明30℃和38℃條件下孵育制備的載藥囊泡功能與室溫(25℃)孵育制備的無差異。