[發明專利]一種檢測四種主要禽呼吸道癥候群病毒的方法

在審

• 申請號: 202010113311.4
• 申請日: 2020-02-24
• 公開（公告）號: CN111254221A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 王楷宬;王素春;莊青葉;李陽;姜楠;姜利建;黃保續;劉華雷
• 申請（專利權）人: 中國動物衛生與流行病學中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種同時檢測禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒的引物對和探針組，其特征在于，所述的引物對和探針組的序列信息如下：

禽流感病毒檢測正向引物AIV forward的序列為SEQ ID NO:1、

禽流感病毒檢測反向引物AIV reverse的序列為SEQ ID NO:2、

禽流感病毒檢測探針AIV probe的序列為SEQ ID NO:3；

新城疫病毒檢測正向引物NDV forward的序列為SEQ ID NO:4、

新城疫病毒檢測反向引物NDV reverse的序列為SEQ ID NO:5、

新城疫病毒檢測探針NDV probe的序列為SEQ ID NO:6；

禽傳染性支氣管炎病毒檢測正向引物IBV forward的序列為SEQ ID NO:7、

禽傳染性支氣管炎病毒檢測反向引物IBV reverse的序列為SEQ ID NO:8、

禽傳染性支氣管炎病毒檢測探針IBV probe的序列為SEQ ID NO:9；

雞傳染性喉氣管炎病毒檢測正向引物ILTV forward的序列為SEQ ID NO:10、

雞傳染性喉氣管炎病毒檢測反向引物ILTV reverse的序列為SEQ ID NO:11、

雞傳染性喉氣管炎病毒檢測探針ILTV probe的序列為SEQ ID NO:12。

2.如權利要求1所述的引物對和探針組，其特征在于，所述的檢測禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒的探針的5′端用不同的羧基熒光素進行標記；3′端用不同的淬滅基團進行標記。

3.如權利要求2所述的引物對和探針組，其特征在于，所述的禽流感病毒檢測探針AIVprobe針的5′端進行羧基熒光素ROX標記，3′端進行淬滅基團BHQ2標記。

4.如權利要求2所述的引物對和探針組，其特征在于，所述的新城疫病毒檢測探針NDVprobe 5′端進行羧基熒光素FAM標記，3′端進行淬滅基團BHQ1標記。

5.如權利要求2所述的引物對和探針組，其特征在于，所述的傳染性支氣管炎病毒檢測IBV probe 5′端進行羧基熒光素HEX標記，3′端進行淬滅基團BHQ1標記。

6.如權利要求2所述的引物對和探針組，其特征在于，所述的雞傳染性喉氣管炎病毒檢測ILTV probe 5′端進行羧基熒光素CY5標記，3′端進行淬滅基團BHQ2標記。

7.權利要求1-6任一項所述的引物對和探針組在制備檢測禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒的試劑盒中的應用。

8.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的試劑盒為熒光RT-PCR檢測試劑盒。

9.一種熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光RT-PCR檢測試劑盒中包含有權利要求1-6任一項所述的引物對和探針組。

10.一種檢測臨床樣品中禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒的四重熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟：

1)配制熒光定量RT-PCR反應體系

反應液每管50μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ25.0μL，5U/μL TaKaRa Ex TaqHS 1.0μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1.0μL，10pmol/μL AIV forward、AIV reverse和AIV probe各1.0μL，10pmol/μL NDV forward、NDV reverse和NDV probe各1.0μL，10pmol/μL IBV forward、IBV reverse和IBV probe各1.0μL，10pmol/μL ILTV forward、ILTVreverse和ILTV probe各1.0μL，RNaseFree dH2O 7.0μL，待檢測的樣品RNA模板4μL；

2)熒光定量RT-PCR反應體系擴增

將檢測反應條件設置為：第一階段，42℃/5min；第二階段，95℃/10s，第三階段，95℃/5s，60℃/20s收集熒光，40個循環；保存文件，運行；

3)結果判定

結果分析條件設定：讀取檢測結果，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，不同儀器可對閾值線的位置進行調整，然后讀取檢測結果；

質控標準:陰性對照無Ct值并且無擴增曲線；陽性對照的Ct值應≤36.0，并出現特定的擴增曲線；如陰性對照和陽性條件不滿足以上條件，此次實驗視為無效；

結果描述及判定如下:禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性喉氣管炎病毒的探針分別標記了ROX熒光、FAM熒光、HEX熒光和CY5熒光；如果無Ct值并且無熒光擴增曲線，樣品判為四種病毒均為陰性；如果出現其中一種熒光擴增曲線，且Ct值≤36，則判定為該熒光對應的病毒陽性，其他三種病毒陰性；如果出現多種熒光擴增曲線，且Ct值均≤36，則判定為該這幾種熒光對應的病毒均為陽性，其余病毒為陰性。