[發(fā)明專利]人睪丸間質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010113071.8
• 申請日: 2020-02-24
• 公開（公告）號: CN111394302B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 項鵬;鄧春華;夏凱;柯瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;G01N33/569;A61K35/28;A61P15/08
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

本發(fā)明公開了一種人睪丸間質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)方法。本發(fā)明研究提出一種人睪丸組織中特異表達于人睪丸間質(zhì)干細胞(SLC)的特異性標志物，即CD248蛋白，以用于從人睪丸組織識別和分離高純度的人SLC。并以此建立了從人睪丸組織中分離獲得高純度SLC的方法，所得SLC無睪丸中其他類型細胞的混入，純度高。同時還對人SLC的培養(yǎng)體系進行了優(yōu)化改進，所得睪丸間質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基成分明確，有利于標準化，并據(jù)此建立了睪丸間質(zhì)干細胞高效穩(wěn)定的培養(yǎng)擴增體系。本發(fā)明可從人睪丸組織中獲得高純度的人SLC，為睪丸間質(zhì)干細胞治療男性性腺功能減退癥的臨床轉(zhuǎn)化提供了高質(zhì)量的種子細胞，對推動人SLC的特性研究，尤其是SLC的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種人睪丸間質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

男性體內(nèi)超過95％以上的睪酮是由睪丸間質(zhì)細胞(Leydig cell,LC)合成和分泌的。當由于先天性、獲得性疾病引起LC合成睪酮能力不足，就會發(fā)生男性性腺功能減退，導(dǎo)致性功能障礙和男性不育；而且與骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、向心性肥胖、記憶力和認知功能下降、糖尿病、心腦血管疾病等重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)(N Engl J Med.2013；JAMAIntern Med.2017；JAMA.2017；Aging Male.2018鄧春華等)。目前，臨床上僅能通過補充外源性雄激素(Testosterone Replacement Therapy,TRT)緩解男性性腺功能減退的部分臨床癥狀，但存在以下明顯缺陷：1.需要長期給藥；2.喪失晝夜節(jié)律；3.增加心腦血管事件及前列腺癌的風險；4.損害生精功能，造成男性不育問題(N Engl J Med.2015；J Am CollCardiol.2016)。由于上述缺陷，接受TRT治療的男性不足性腺功能減退患者的2％。因此，研發(fā)一種治療男性性腺功能減退的的新療法，具有重大的科學意義與社會意義。

睪丸間質(zhì)干細胞(Stem Leydig Cell,SLC)是男性性腺特異性干細胞，可分化為睪丸間質(zhì)細胞(LC)，對維持LC數(shù)量、功能和睪丸微環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要(Proc Natl Acad Sci US A.2006,2016)，是理想的LC替代的種子細胞。但是目前研究主要局限在大鼠、小鼠等嚙齒類動物的SLC。由于缺乏高效的分離培養(yǎng)體系，人SLC的特性及能否實現(xiàn)SLC治療的臨床轉(zhuǎn)化尚不清晰。由于這些原因，迫切需要研究用于鑒定和分離人類SLC的實用方法。

近年來不少研究致力于建立人SLC的鑒定、分離及培養(yǎng)體系。據(jù)文獻報道，2014年Landreh等人首次使用睪丸活檢組織進行睪丸外植體培養(yǎng)，據(jù)此發(fā)現(xiàn)人睪丸管周肌樣細胞(TPC)含有SLC，這些SLC在體外經(jīng)過誘導(dǎo)分化擁有合成類固醇的潛力。但是人類TPC是混合的細胞群，除了SLC之外還包含其他類型的細胞，例如肌樣細胞和LC。因此，這種用于分離人SLC的方法還有許多不足之處。2017年我們的研究小組首次通過流式細胞分選睪丸組織中p75NTR陽性SLC。p75NTR⁺SLC表達了傳統(tǒng)的SLC標記物Nestin，具有克隆形成自我更新的能力，并具有多譜系分化潛能。更重要的是，p75NTR⁺SLC分化為功能性LC，這些功能性LC表達了LC標志物，并且能夠產(chǎn)生睪酮。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，p75NTR可以作為鑒定和分離人SLC的新型表面標記。不幸的是，已經(jīng)證明p75NTR還在粗線精子細胞和圓形精子上表達，這將導(dǎo)致基于p75NTR的分選系統(tǒng)會把部分生精細胞分離下來，從而降低了SLC群體的純度，移植后可能引起免疫排斥并具有潛在的倫理問題。2019年Eliveld等使用PDGFRα作為標志物，從人類睪丸中分離出了相似的SLC細胞。這些細胞表現(xiàn)出間充質(zhì)干細胞(MSCs)的特征，并能夠分化為具有LCs特征的類固醇生成細胞。然而，值得注意的是，PDGFRα也在多個發(fā)育階段的LC上均有表達。因此，PDGFRα⁺SLC的純度問題仍有待解決。

綜上，這些文獻或專利報道的分離人SLC均純度低下，因此有可能誤導(dǎo)我們對人SLC的研究和認識，尤其是限制人SLC的臨床轉(zhuǎn)化。因此，鑒定人睪丸SLC特異性表達的蛋白標志物以及據(jù)此建立高效的人SLC分離體系至關(guān)重要。