[發(fā)明專利]一種蘋(píng)果抗病相關(guān)基因MdHAL3及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010110625.9
• 申請(qǐng)日: 2020-02-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111118034B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬躍;王豐;楊爽;姜秋;史佳俊;張志宏;邵俊花
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/66;A01H5/12;A01H6/74
• 代理公司: 沈陽(yáng)科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 胡野

1.基因MdHAL3在提高蘋(píng)果植株對(duì)炭疽病抗病性和生根能力中的應(yīng)用，其特征是：所述基因MdHAL3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述基因MdHAL3編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因MdHAL3在提高蘋(píng)果植株對(duì)炭疽病抗病性和生根能力中的應(yīng)用，其特征是：所述基因MdHAL3的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

（1）MdHAL3基因的克隆

①RNA提取：采用改良CTAB法提取蘋(píng)果植株葉片的總RNA之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈；

②基因的克隆：以所述cDNA第一鏈為模板，利用引物?MdHAL3-F和MdHAL3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，獲得645bp的目的片段；

MdHAL3-F核苷酸序列見(jiàn)?SEQ?ID?NO:3；所述MdHAL3-R核苷酸序列見(jiàn)?SEQ?ID?NO:4；

（2）植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

①?利用植物表達(dá)載體，選用EcoR?I和BamH?I限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pRI101-CaMV35S和含有MdHAL3基因的PMD18-T進(jìn)行雙酶切；回收載體大片段和目的基因小片段，用T4DNA連接酶過(guò)夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，鑒定重組子后即可進(jìn)行雙酶切；

②選取雙酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒，測(cè)序后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EH105感受態(tài)細(xì)胞，得到的含有MdHAL3重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化蘋(píng)果植株；

（3）蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化

當(dāng)繼代生長(zhǎng)約20-28?d的試管苗用于轉(zhuǎn)化材料，從酵母菌（YEP）固體培養(yǎng)基上挑取部分之前菌落PCR驗(yàn)證正確的MdHAL3重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌落，將其加到含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃條件下、180?rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日早上取搖好的菌液與新的不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基按照1：50的比例充分混合均勻，然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4-0.6之間，得到混合菌液；所述含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基配方包括：10?g·L^-1胰蛋白胨，10?g·L^-1酵母浸粉，5?g·L^-1?NaCl，卡那霉素50?mg·L^-1，利福平100?mg·L^-1；

將所述混合菌液離心收集菌種，再用等體積的含有B5?維生素、15?g?L^-1?蔗糖、5?g?L^-1葡萄糖的液體培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌，對(duì)蘋(píng)果試管苗葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，?3-4?周后出現(xiàn)愈傷組織和不定芽，并將長(zhǎng)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入到光下進(jìn)行培養(yǎng)，在含有50mg/ml的卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)入MdHAL3基因的陽(yáng)性植株。