[發明專利]一種煙草專用復合菌菌液及其制備方法

有效

• 申請號: 202010109907.7
• 申請日: 2020-02-23
• 公開（公告）號: CN111349571B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 黃家福;潘裕添;林志超;吳啟賜;張國廣
• 申請（專利權）人: 閩南師范大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/20;C05G3/00;C05G3/60;C05G3/80;C12R1/645;C12R1/07;C12R1/065;C12R1/885;C12R1/465;C12R1/55
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張磊

1.一種煙草專用固體復合生物菌肥的制備方法，其特征在于：它包括以下步驟：

Ⅰ.制備煙草專用復合菌菌液，并回收制備平菇加工廢料提取液時產生的平菇濾渣以及平菇多糖；

Ⅱ.將回收的平菇濾渣以及平菇多糖在30-35℃下干燥4-6h；

Ⅲ.以重量份數比計，將制備的煙草專用復合菌菌液50-80份、干燥的平菇多糖2-3份、干燥的平菇濾渣15-20份、泥炭50-60份、膨潤土40-50份混合均勻后，在28-30℃下干燥，使其含水量為8-10%，即得所述煙草專用固體復合生物菌肥；

所述煙草專用復合菌菌液由如下重量份的原料制備而成：平菇加工廢料提取液40-50份、膠質芽孢桿菌菌劑15-20份、褐球固氮菌菌劑20-25份、哈茨木霉菌菌劑10-15份、淡天藍色鏈霉菌菌劑5-10份、刺孢吸水鏈霉菌菌劑5-10份；所述膠質芽孢桿菌菌劑、褐球固氮菌菌劑、哈茨木霉菌菌劑、淡天藍色鏈霉菌菌劑以及刺孢吸水鏈霉菌菌劑的活菌數均為2~4億個/mL；

所述的煙草專用復合菌菌液的制作工藝，它包括以下步驟：

（1）制備平菇加工廢料提取液；（2）活化各菌種；（3）制備膠質芽孢桿菌種子懸液、褐球固氮菌種子懸液、哈茨木霉菌種子懸液、淡天藍色鏈霉菌種子懸液、刺孢吸水鏈霉菌種子懸液；（4）制備膠質芽孢桿菌菌劑、褐球固氮菌菌劑、哈茨木霉菌菌劑、淡天藍色鏈霉菌菌劑、刺孢吸水鏈霉菌菌劑；（5）制備菌液；

其中，步驟（1）制備平菇加工廢料提取液的方法為：

將平菇加工過程產生的菇腳以及碎菇洗凈之后粉碎至20-50目，按平菇與水的重量比為1:2的比例加入水，加熱至85-90℃，在此溫度下熬煮1-2h，之后冷卻、過濾，收集濾液并回收濾渣，該濾渣為平菇濾渣；將收集的濾液在1500- 2500r/min轉速下離心5-10min，取上清液；將所得的上清液利用降膜蒸發器降膜蒸發濃縮，濃縮至溶液折光率達到30-40% ，得濃縮液； 之后，在濃縮液中添加80~95%的乙醇，對濃縮液進行變性，其中，所加入的乙醇與濃縮液的體積比為3:2；對變性后的濃縮液進行過濾，收集濾液并回收經變性后所產生的沉淀，該沉淀為平菇多糖；將濾液進行旋轉蒸發除去乙醇；將旋轉蒸發后所得的溶液利用截留分子量為5-10K的濾膜進行切向流過濾，收集濾出液，即得所述平菇加工廢料提取液；

步驟（2）活化各菌種的方法為：

將膠質芽孢桿菌與褐球固氮菌分別接種于含有固體培養基A的斜面上，分開培養48-72h，培養時培養溫度控制在25~35℃；

其中，固體培養基A為K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCO₃·2H₂O、Na₂Mo·2H₂O、酵母膏、甘露醇、FeCl₃以及瓊脂混合后制得的培養基；

將哈茨木霉菌接種于含有PDA斜面培養基的斜面上培養5-7天，培養時培養溫度控制在25~28℃；

將淡天藍色鏈霉菌接種于含有高氏合成一號瓊脂培養基的斜面上培養5-7天，培養時培養溫度控制在28~30℃；

將刺孢吸水鏈霉菌接種于含有高氏合成一號瓊脂培養基的斜面上培養5-7天，培養時培養溫度控制在30℃；

步驟（3）制備膠質芽孢桿菌種子懸液、褐球固氮菌種子懸液、哈茨木霉菌種子懸液、淡天藍色鏈霉菌種子懸液、刺孢吸水鏈霉菌種子懸液的方法為：

用接種環各挑取1環步驟（2）已活化的膠質芽孢桿菌、褐球固氮菌、哈茨木霉菌、淡天藍色鏈霉菌、刺孢吸水鏈霉菌，分別對應接入裝有100-150mL的液體培養基A、液體培養基A、PDA液體培養基、高氏合成一號液體培養基、高氏合成一號液體培養基的5個三角瓶中進行培養，其中，膠質芽孢桿菌與褐球固氮菌在150-200 rpm、25-35℃條件下，搖床振蕩培養24-48h ；哈茨木霉菌在150-200 rpm、25-28℃條件下，搖床振蕩培養5-7天；淡天藍色鏈霉菌在150-200 rpm、28-30℃條件下，搖床振蕩培養5-7天；刺孢吸水鏈霉菌在150-200rpm、30℃條件下，搖床振蕩培養5-7天，即分別得所述膠質芽孢桿菌種子懸液、褐球固氮菌種子懸液、哈茨木霉菌種子懸液、淡天藍色鏈霉菌種子懸液、刺孢吸水鏈霉菌種子懸液；其中，液體培養基A為K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCO₃·2H₂O、Na₂Mo·2H₂O、酵母膏、甘露醇、FeCl₃混合后制得的培養基；

步驟（4）制備膠質芽孢桿菌菌劑、褐球固氮菌菌劑、哈茨木霉菌菌劑、淡天藍色鏈霉菌菌劑、刺孢吸水鏈霉菌菌劑的方法為：

取部分步驟（1）所得的平菇加工廢料提取液并將其的pH調節至7.0-7.2，再經121-122℃，濕熱滅菌10-20min，得培養液；

取5個250mL的三角瓶，將所得的培養液置于三角瓶中，且每個三角瓶中培養液的體積為80-90mL；接著，將步驟（3）所得的膠質芽孢桿菌種子懸液、褐球固氮菌種子懸液、哈茨木霉菌種子懸液、淡天藍色鏈霉菌種子懸液、刺孢吸水鏈霉菌種子懸液分別接種于對應的三角瓶中，且每個三角瓶的接種量均為5%-8%；接種之后，在28-30℃，轉速為100-250rpm的條件下，進行振蕩培養，其中，膠質芽孢桿菌與褐球固氮菌培養48-72h，哈茨木霉菌、淡天藍色鏈霉菌以及刺孢吸水鏈霉菌培養7-9天，使各菌劑的活菌數為均為2~4億個/mL，即分別得所述膠質芽孢桿菌菌劑、褐球固氮菌菌劑、哈茨木霉菌菌劑、淡天藍色鏈霉菌菌劑、刺孢吸水鏈霉菌菌劑；

步驟（5）制備菌液的方法為：取部分步驟（1）所得的平菇加工廢料提取液并將其經121-122℃，濕熱滅菌10-20min；將滅菌后的平菇加工廢料提取液、膠質芽孢桿菌菌劑、褐球固氮菌菌劑、哈茨木霉菌菌劑、淡天藍色鏈霉菌菌劑以及刺孢吸水鏈霉菌菌劑按照重量份混合均勻，即得所述煙草專用復合菌菌液。

2.一種由權利要求1所述的制備方法制備的煙草專用固體復合生物菌肥。