[發明專利]鑒別豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR引物及方法

有效

• 申請號: 202010109705.2
• 申請日: 2020-02-22
• 公開（公告）號: CN111154917B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 白娟;呂林;姜平;王先煒
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發明涉及生物毒株鑒別技術領域，具體公開了鑒別豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR引物及方法，提取待鑒別病毒DNA，采用本發明設計的引物進行第一步擴增，擴增出兩條條帶的為變異株或HB98疫苗毒株，擴增出1條條帶的為經典毒株；擴增出兩條條帶的病毒DNA再進行第二步擴增，擴增產物分子量大小為211bp的為變異株,擴增產物分子量大小為293bp的為HB98疫苗毒株。第一步PCR的敏感度可以達到10TCID₅₀病毒量或0.01ng/ml質粒量，而第二步PCR敏感度達到10TCID₅₀病毒量或者0.1ng/ml質粒量。該敏感度可以有效的檢測出臨床病料中是否有偽狂犬病毒感染，并區分出偽狂犬病毒經典毒株或者變異毒株感染，并且準確率高。

技術領域

本發明涉及生物毒株鑒別技術領域，特別涉及鑒別豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR引物及檢測方法。

背景技術

偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)是皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科的雙股DNA病毒，基因組在140kd左右，編碼69個開放閱讀框。該病毒主要引起母豬流產、死胎及呼吸系統癥狀，仔豬出現神經癥狀和腹瀉，給養豬業造成了巨大的經濟損失。目前，歐美洲很多國家通過免疫接種和凈化技術已經根除該病。我國近十多年內通過采用強化免疫和凈化技術，該病也得到有效控制。但是，2011年末，我國PRV疫苗免疫豬場再次暴發該病。全基因組分析結果也表明，此次新發的偽狂犬病病毒與之前的經典偽狂犬病毒屬于不同的亞群，其抗原性發生了變化，變異毒株位于一個新的基因分支。因此建立PRV變異毒株和經典毒株鑒別方法十分必要。

目前現有的檢測偽狂犬病毒感染的PCR方法有很多，其中最常用的兩種是國標法與偽狂犬gE基因檢測法。國標法主要針對偽狂犬病毒gD基因，可以特異的擴增出220bp的片段。因為gD基因是偽狂犬病毒感染過程中一個重要的囊膜蛋白，包括疫苗毒與野毒在內的各種類型的偽狂犬病毒(gD缺失的偽狂犬病毒除外)都存在該基因，所以該方法可以用于鑒別偽狂犬病毒的感染與否，但不能夠區分疫苗毒與野毒株。而偽狂犬病毒gE基因檢測法主要用于鑒別疫苗毒與野毒株，野毒株可以擴增出632bp的片段，而疫苗毒由于缺失了gE基因，所以不能擴增出相應的片段。因為現階段豬場都有Bartha-K61等疫苗免疫，所以國標方法不再適合進行鑒別，而用于區分疫苗毒與野毒的偽狂犬病毒gE基因檢測法得到了很好的應用，但是由于偽狂犬病毒變異毒株的出現，使這一方法受到了局限。該方法不能夠區分出變異毒株與經典毒株，而變異毒株與經典毒株的區分在免疫與監測上又至關重要，所以需要一種可以有效區分偽狂犬病毒經典毒株與變異毒株的PCR診斷方法。

發明內容

為了有效的預控偽狂犬病的發生，區分出經典毒株與變異毒株的感染及其流行的區域至關重要。本研究通過不同毒力毒株全基因組序列比對，找到了經典毒株與變異毒株的基因差異區域UL44和UL36，設計PCR引物，建立了兩步法PCR，具有較高特異性和敏感性，可用于鑒別PRV經典毒株與變異毒株，為該病診斷提供了有效方法。

本發明的技術方案包括以下內容：

用于鑒別豬偽狂犬病毒變異毒株的PCR引物組，該PCR引物組包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：

1F-C：5’-ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG-3’，

1F-V：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，

1R：5’-GGCCACGCGCACGGACACC-3’，

2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，

2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。