[發明專利]一種人臍帶血間充質干細胞的培養方法

有效

• 申請號: 202010109042.4
• 申請日: 2020-02-21
• 公開（公告）號: CN111235100B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 張俊河;柴樹潔;張繼紅;高建輝;單琳琳;楊雯雯;楊獻軍
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 郭佳效

1.一種人臍帶血間充質干細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：將臍帶血單個核細胞用第一培養基培養至細胞生長狀態穩定，后續改用第二培養基進行培養，其中，所述第一培養基主要由基礎培養基、胎牛血清、抗生素和間充質干細胞生長添加物組成，其中胎牛血清體積占比為8-12％，間充質干細胞生長添加物體積占比為0.1-0.2％；所述第二培養基主要由基礎培養基、胎牛血清、抗生素組成，其中胎牛血清體積占比為8-12％；所述基礎培養基為DMEM/F12培養基；

所述臍帶血取自早產兒；所述間充質干細胞生長添加物來自美國ScienCell公司；

所述生長狀態穩定是用第一培養基對單個核細胞進行原代培養及傳代培養至第2代，后續傳代培養改用第二培養基；

所述原代培養包括用第一培養基將所述單個核細胞制成單細胞懸液，然后按細胞密度5×10⁶-2×10⁷個/mL將單個核細胞接種于細胞培養瓶中；

所述原代培養時，單個核細胞接種于細胞培養瓶后，2天后半量換液，5-7天后首次全量換液，以后每3-4天全量換液；

所述第一培養基、第二培養基中抗生素的含量為：100-120U/mL青霉素、100-120μg/mL鏈霉素和0.25-0.5μg/mL兩性霉素B。

2.根據權利要求1所述的人臍帶血間充質干細胞的培養方法，其特征在于，所述原代培養時，待細胞培養瓶中細胞融合度達到70～80％，進行傳代培養。

3.根據權利要求1所述的人臍帶血間充質干細胞的培養方法，其特征在于，所述細胞培養瓶用明膠進行包被處理。

4.根據權利要求1所述的人臍帶血間充質干細胞的培養方法，其特征在于，采用淋巴細胞分離液法分離出臍帶血單個核細胞。

5.根據權利要求4所述的人臍帶血間充質干細胞的培養方法，其特征在于，單個核細胞分離的具體步驟為：

1)無菌條件下抽取新生兒的臍帶血，肝素抗凝，得到肝素抗凝臍帶血；

2)使用D-Hanks平衡鹽溶液等比例稀釋肝素抗凝臍帶血；

3)將稀釋肝素抗凝臍帶血疊加到淋巴細胞分離液上得混合液，稀釋肝素抗凝臍帶血與淋巴細胞分離液的高度比為2:1；

4)將步驟3)所得的混合液以1500-2000r/min離心20-25min，吸取界面處的白色云霧層，用PBS平衡鹽溶液1000-1500r/min離心、洗滌沉淀共2次。