[發(fā)明專利]賴氨酸生物制造中宏觀動力學與細胞代謝通量耦合建模方法

有效

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• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111341382B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設計）人: 劉飛;潘妍如;王志國;欒小麗
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G16B5/00
• 分類號: G16B5/00;G16B40/00;G06N3/126;G06N3/006
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉;劉秋彤

1.賴氨酸生物制造中宏觀動力學與細胞代謝通量耦合建模方法，其特征在于，步驟包括：

第一步：對賴氨酸制造過程的代謝網(wǎng)絡進行約簡：

以糖酵解為碳源的主要途徑，簡化磷酸戊糖途徑，忽略糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑之間的關聯(lián)，不考慮乙醛酸循環(huán)，約簡后代謝網(wǎng)絡包含糖酵解、TCA循環(huán)、產(chǎn)物生成、氧化磷酸化四個代謝路徑，涉及到的代謝物有萄糖-6-磷酸G6P、核酮糖-5-磷酸R5P、丙酮酸Pyr、乙酰輔酶AAcCoA、檸檬酸Cit、α-酮戊二酸αKG、草酰乙酸Oxa、賴氨酸Lys、ATP和NADH；

第二步：建立代謝通量平衡方程：

擬穩(wěn)態(tài)下代謝物的通量平衡方程為S_mr＝0，式中S_m為胞內(nèi)代謝物的化學計量矩陣，r表示各個反應的代謝通量向量；由第一步約簡的代謝網(wǎng)絡，平衡方程含有10個細胞內(nèi)代謝物，即萄糖-6-磷酸G6P、核酮糖-5-磷酸R5P、丙酮酸Pyr、乙酰輔酶AAcCoA、檸檬酸Cit、α-酮戊二酸αKG、草酰乙酸Oxa、賴氨酸Lys、ATP和NADH，其中14個代謝通量表示為：

r＝[r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈,r_S,r_P,r_B1,r_B2,r_B3,r_O2]^T

上式r中的各分量在約簡的代謝網(wǎng)絡中標出，其中，其中，r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈分別表示內(nèi)部一般代謝通量，r_O2表示氧化磷酸化的總通量，r_P,r_S分別是比產(chǎn)物生成速率和比底物消耗速率，r_B1,r_B2,r_B3是不同的細胞物質合成通量，統(tǒng)一換算成比生長率μ來表示，即r_B1＝b₁μ，r_B2＝b₂μ,r_B3＝b₃μ,其中b₁,b₂,b₃是待辨識的模型參數(shù)；

針對10個細胞內(nèi)代謝物，將通量平衡方程S_mr＝0與約簡的代謝路徑中代謝反應相結合，再考慮氧化磷酸化合成ATP的過程，建立如下代謝通量平衡方程：

其中，P/O為合成ATP的分子系數(shù)，Y_ATP,m_ATP為ATP對細胞生長和維持代謝的比攝取速率參數(shù)，均為待辨識的模型參數(shù)；

第三步：建立質量動力學方程：

構建生物量濃度、產(chǎn)物生成濃度和底物消耗濃度的動力學方程：

式中，M_P是產(chǎn)物的相對分子質量，M_S是底物的相對分子質量，r_P稱為比產(chǎn)物生成速率，r_S稱為比底物消耗速率；

第四步：構建代謝通量與動力學變量的耦合關系：

將比生長率μ、比產(chǎn)物生成速率r_P、比底物消耗速率r_S與生物量濃度和底物濃度進行關聯(lián)，借助濃度變化來描述代謝通量的變化；對于比產(chǎn)物生成速率，采用以下Luedeking-Piret經(jīng)驗公式：

r_P＝αμX+βX???????????????????????????????????(5)

式中，α為生長偶聯(lián)系數(shù)，β為非生偶聯(lián)系數(shù)，對于賴氨酸發(fā)酵，α≠0，β≠0；

對于比底物消耗速率，采用以下雙選機制：

r_S＝min{r_S,M,r_S,R}??????????????????????????????????(6)

即比底物消耗速率r_S選擇r_S,M和r_S,R中的最小值的通過，分別地：

其中r_Smax為最大比底物消耗速率，K_s為半飽和參數(shù)，

式中，r_Smin為最小速率值，k₁和k₂表示滯后發(fā)生的瞬時狀態(tài)；

第五步：重構代謝通量平衡方程：

利用通量平衡方程(1)，將內(nèi)部代謝通量r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈和r_O2依次表示為比生長率μ、比產(chǎn)物生成速率r_P和比底物消耗速率r_S的線性組合：

進一步將通量平衡方程(1)與比產(chǎn)物生成速率公式(5)結合得到：

第六步：耦合模型參數(shù)的辨識：

公式(2)-(10)給出了賴氨酸發(fā)酵動力學與細胞代謝流耦合模型，用于描述動力學變量X,P,S和代謝通量r的變化規(guī)律，模型中有13個未知參數(shù)需要利用實驗測量值來進行辨識，待辨識的參數(shù)集θ表示如下：

θ＝{α,β,r_Smax,r_Smin,K_s,k₁,k₂,b₁,b₂,b₃,Y_ATP,m_ATP,P/O}

利用賴氨酸發(fā)酵過程實驗測得的生物量濃度X_E、產(chǎn)物濃度P_E和底物濃度S_E，對模型參數(shù)集θ進行辨識，步驟如下：

步驟1：采集N次實驗測量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)；

步驟2：給定初始參數(shù)θ；

步驟3：將θ代入公式(5)-(10)，通過變量μ,r_P,r_S聯(lián)立動力學方程(2)-(4)；

步驟4：利用計算機數(shù)值解法計算生物量濃度、產(chǎn)物濃度和底物濃度在時刻i的仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)；

步驟5：設立偏差目標函數(shù)，計算實驗測量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)與仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)之間的偏差，判斷是否滿足期望的目標，當不滿足時則通過智能尋優(yōu)算法，選擇新的一組參數(shù)θ，返回步驟3，不斷循環(huán)逼近實驗測量值，尋求期望的參數(shù)θ；

步驟6：當滿足期望的目標時，則獲得期望的參數(shù)θ；

第七步：智能尋優(yōu)算法的實現(xiàn)：

用遺傳算法來尋找模型參數(shù)，首先是通過染色體的形式把待辨識的參數(shù)進行編碼，定義一個染色體為參數(shù)集θ的一組可行解，多個染色體則為種群；每一個染色體又由多個基因組成；

第八步：動力學與代謝流耦合模型的使用：

將辨識得到的參數(shù)集θ代入公式(2)-(10)；首先由公式(2)-(4)獲得生物量濃度、產(chǎn)物生成濃度和底物消耗濃度的動力學描述；然后由公式(10)計算比生長率μ的變化，由公式(5)計算比產(chǎn)物生成速率r_P，由公式(6)-(8)計算比底物消耗速率r_S；最后通過公式(9)映射獲得細胞內(nèi)部代謝通量r。