[發明專利]基于芬頓反應構建的ELISA可視化檢測試劑盒及其在檢測ZEN中的應用

在審

• 申請號: 202010106727.3
• 申請日: 2020-02-21
• 公開（公告）號: CN111175509A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 翁祖銓;陳家敏;黃達
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;C07D313/00
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 修斯文;蔡學俊

本發明公開了一種基于芬頓反應構建的新型酶聯免疫反應（ELISA）可視化檢測試劑盒及其在檢測ZEN中的應用。該試劑盒由ZEN單克隆抗體、人工抗原ZEN?CAT、H₂O₂、FeCl₂和Au NRs組成，其通過Fe²⁺加速H₂O₂對Au NRs的刻蝕作用，導致Au NRs的顏色發生變化，從而可根據Au NRs的顏色變化程度判斷出ZEN的大致濃度，或根據Au NRs縱向等離子共振吸收峰的藍移，利用紫外吸收曲線實現對ZEN濃度的精確定量。本發明中Au NRs的制備方法簡單易得，并且可以實現多重顯色，因而可以實現對飼料中ZEN濃度的簡便分析，具有操作簡單，靈敏度和選擇性高的特點，易于推廣使用。

技術領域

本發明屬于食品分析領域，具體涉及一種基于芬頓反應對Au NRs的刻蝕作用構建的新型酶聯免疫反應（ELISA）可視化檢測試劑盒及其在檢測玉米赤霉烯酮（ZEN）中的應用。

背景技術

玉米赤霉烯酮(ZENralenone，ZEN)又稱F-2毒素，主要是由粉紅鐮刀菌及禾谷鐮刀菌產生的一種非甾體。ZEN不僅具有動物雌性激素作用，還是某些真菌的性激素。ZEN能引起動物流產、死胎、返情等生殖機能異常，還可以導致生長下降、免疫抑制、不育、畸形等。由于我國多數地區雨量充沛，相對濕度較高，谷物和動物飼料更易受到霉菌毒素污染，尤其玉米、小麥、燕麥和大麥等作物易受到ZEN污染。通過國內外對ZEN毒性機理的研究發現它主要通過影響機體的生殖性能，引起細胞凋亡、致畸、損傷DNA、氧化損害、影響免疫機能等機制，來影響動物與人類的健康。通過對ZEN毒性的研究發現它對植物的毒性主要體現在它與植物的受精、授粉有關，而它對動物的毒性主要體現在它具有生殖發育毒性、免疫毒性、肝腎毒性及它對內分泌系統的影響。

調查發現ZEN在飼料廠抽取的樣品中污染最大，而在糧食集散地、養殖場（戶）中污染最輕。這與飼料廠中玉米類樣品較多而玉米類樣品受到ZEN污染最嚴重有關。當豬食用了被ZEN污染的飼料后，育肥豬除精神輕度興奮、食欲輕度下降外，主要表現為泌尿生殖器官的發情樣癥狀。動物一旦食用了被ZEN污染的飼料后沒有特效藥能夠對它們進行治療，所以ZEN的檢測變得尤為重要。

檢測ZEN的方法主要有色譜法和免疫學方法。色譜法如氣相色譜-質譜聯用法和高效液相色譜法等，具有檢測靈敏、可靠的特點，但是需要昂貴儀器，并且檢測所需時間長，對操作人員要求較高。免疫學方法具有簡便、靈敏、快捷、成本低、適合大批量檢測等特點，尤其適合我國很多生產企業單位的自檢。目前國內外對利用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測ZEN有較多研究，并取得了一定成果。但是與進口試劑盒相比，國內的檢測試劑盒存在檢測范圍較窄、靈敏度不高的缺點。

發明內容

鑒于上述現有技術中的不足，本發明的目的在于提供一種基于芬頓反應構建的新型酶聯免疫反應（ELISA）可視化檢測試劑盒，其是在ELISA反應的基礎上，引入Au NRs作為顯色底物，以改變傳統ELISA單一顯色的問題。本發明基于芬頓反應構建新型ELISA可視化檢測試劑盒對ZEN進行檢測，是在ZEN和人工抗原ZEN-CAT可與抗體結合特異性的基礎上，利用芬頓反應對Au NRs的刻蝕作用導致Au NRs顏色改變達到顯色的效果，以最終通過Au NRs的顏色變化對ZEN濃度進行可視化檢測及精確定量測定。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于芬頓反應構建的ELISA可視化檢測試劑盒，其包括ZEN單克隆抗體、人工抗原ZEN-CAT、H₂O₂、FeCl₂和金納米棒（Au NRs），其利用Fe²⁺的催化作用加速H₂O₂對Au NRs的刻蝕，而通過Au NRs的顏色變化進行測定。

所述人工抗原ZEN-CAT的合成包括半抗原的合成及人工抗原的合成兩個部分，其具體步驟為：