[發明專利]一種固定化金屬離子親和色譜微球材料及其制備與應用

有效

• 申請號: 202010105968.6
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN113351190B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 馬淑娟;唐睿智;歐俊杰;葉明亮
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;B01J20/30;C07K1/22;G01N27/64;G01N30/08
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種以環氧聚合物微球為基質的固定化金屬離子親和色譜材料及其在磷酸化肽富集中的應用。具體是，首先以烯丙基縮水甘油醚和季戊四醇四丙烯酸酯為原料，采用懸浮聚合法方法制備了帶有環氧基團的多孔聚合物微球，然后以該聚合物微球為基質，以帶有磷酸根官能團的O?磷酸?L?絲氨酸為修飾劑，在堿性條件下通過環氧?氨開環反應，在材料表面引入磷酸官能團，最后通過螯合鈦離子得到了可用于富集磷酸肽的Tisupgt;4+/supgt;?IMAC材料。所得到的Tisupgt;4+/supgt;?IMAC材料對磷酸肽有很高的選擇性，可用于生物樣品β?酪蛋白酶解液和人血清中的內源化磷酸化肽的高靈敏度和高選擇性富集。

技術領域

本發明涉及一種以環氧聚合物微球為基質制備具有高比表面積的固定化金屬離子親和色譜(Ti⁴⁺-IMAC)材料及其在蛋白質組學中的應用。具體制備過程是：

首先采用懸浮聚合法制備多孔環氧微球，，隨后利用環氧-胺開環反應將O-磷酸-L-絲氨酸單體一步引入微球表面，再與Ti⁴⁺進行螯合，最終得到Ti⁴+-IMAC微球材料。

背景技術

磷酸化修飾是蛋白組學中極為重要的一類轉錄后修飾，在多種細胞生理活動和過程起到極為重要的作用(文獻1,Ptacek,J.et.al“Global?analysis?of?proteinphosphorylation?in?yeast”,Nature,2005,438,679-684.)。基于質譜分析的蛋白質組學方法是研究磷酸化肽最常用、最有效的工具之一。在“bottom?up”分析策略中，先將目標蛋白酶解，對得到的所有肽段進行特異性富集，最后對富集到的磷酸化肽段進行cLC-MS/MS分析鑒定，這種從多肽層面進行組學分析而的方法也被形象地稱為“鳥槍法”(文獻2,Zhang,Y.et.al“Protein?analysis?by?shotgun/bottom-up?proteomics”,Chemical?Reviews,2013,113(4),2343-2394.)。由于蛋白酶解產物中非磷酸化肽段含量高，而磷酸化肽段豐度極低，要達到理想的分析靈敏度和精確度，磷酸化肽的富集過程就變得尤為重要。

金屬離子親和色譜(IMAC)是常用的磷酸肽富集方法，廣泛應用于磷酸化蛋白組學研究中(文獻3，翟貴金等，“血清磷酸化肽的分離富集和質譜定量及其作為潛在腫瘤標志物的評價”，色譜，2016，34(12)，1192-1198)。這種材料由色譜基質，螯合劑和金屬離子三部分組成。利用螯合在基質上的金屬離子如Fe(III)、Ti(IV)、Zr(IV)等的靜電作用和螯合作用，在強酸性或強磷酸鹽條件下可以高效、高特異性地與磷酸化肽段中的磷酸基團結合，從而將其從大量非磷酸肽中特異性地富集出來。典型的色譜基質材料有納米材料、微球色譜基質、棉纖維、分子印跡材料、整體材料、共價有機骨架材料等(文獻4，相小超等，“功能材料在蛋白質組研究中的應用進展”，色譜，2019，37(11)，1135-1141)。

以聚合物微球為基質的IMAC材料具有制備簡單、分散性好、pH耐受范圍寬、材料化學性能穩定等優點。但是由于與某些酸性肽段發生靜電或螯合作用，IMAC材料中會有大量的非特異性吸附產生。Zou等發現了膦酸酯鈦(鋯)與與磷酸化肽之間的高特異性相互作用，并以此建立了新一代Ti⁴⁺-IMAC材料(文獻5,Zou?H.et.al“Robust?phosphoproteomeenrichment?using?monodisperse?microsphere–based?immobilized?titanium(IV)ionaffinity?chromatography”,Nature?Protocols,2013,8,461-480.)，很大程度提高了富集的特異性和選擇性。但其制備流程復雜，反應條件苛刻，不利于規模化生產和實際應用。因此，發展一種制備方法簡單、條件溫和、特異性高的IMAC材料仍然具有很大的積極意義。

發明內容