[發(fā)明專利]一種針對H3N2犬流感病毒的重組犬源化抗體scFv-Fc

有效

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• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111704665B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永杰;趙丹;韓德敏;董雨豪;趙艷兵
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/70;C12N15/11;A61K39/395;A61P31/16
• 代理公司: 南京禹為知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 宋華

1.一種制備針對 H3N2 亞型 CIV的重組犬源化抗體scFv-Fc的方法，其特征在于：包括，

抽取產(chǎn)生臨床癥狀的H3N2亞型CIV感染犬的外周血，分離出外周淋巴細(xì)胞，通過提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA, PCR 擴(kuò)增獲得抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，以及重鏈恒定區(qū)Fc基因；所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)山柔性肽連接成為scFv基因； 所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；所述連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;所述重鏈恒定區(qū)Fc片段的氨基酸序列如SEQ IDNo.17所示；所述scFv的序列如SEQ ID No.26所示；

將原核表達(dá)載體pET-32a經(jīng)EcoR I和Hand III, Hand III和Xho I雙酶切，獲得線性載體后，分別與上述scFv基因、Fc基因使用同源重組方法進(jìn)行連接，構(gòu)建pET-32a-scFv、pET-32a-Fc表達(dá)載體；

轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，測序正確的陽性菌，經(jīng)分析選出相對最優(yōu)的pET-32a-scFv,提取質(zhì)粒，特異性擴(kuò)增出scFv基因，經(jīng)EcoR I與Hind III雙酶切pET-32a-Fc質(zhì)粒后，利用同源重組方法將scFv基因連接至pET-32a-Fc質(zhì)粒上，構(gòu)建pET-32a-scFv-Fc表達(dá)載體；所述scFv-Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示；

將選定的陽性菌pET-32a-scFv和測序正確的pET-32a-scFv-Fc使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再經(jīng)His標(biāo)記Ni柱純化得到scFv和scFv-Fc抗體。

2.一種權(quán)利要求1所述的方法中用于制備針對H3N2亞型CIV的重組犬源化抗體scFv-Fc的引物，其特征在于：包括，

所述VH-F的序列如SEQ ID NO.l所示；

所述VH-R的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述VL-F的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述VL-R的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述Fc-F的序列如SEQ ID NO.5所示；

所述Fc-R的序列如SEQ ID NO.6所示；

所述CIV-VH-F的序列如SEQ ID NO.7所示；

所述CIV-VH-R的序列如SEQ ID NO.8所示；

所述CIV-VL-F的序列如SEQ ID NO.9所示；

所述CIV-VL-R的序列如SEQ ID NO.10所示；

所述CIV-Fc-F的序列如SEQ ID NO.11所示；

所述CIV-Fc-R的序列如SEQ ID NO.12所示；

所述CE-scFv-F的序列如SEQ ID NO.13所示；

所述CE-scFv-R的序列如SEQ ID NO.14所示。

3.一種如權(quán)利要求1所述的方法制備的重組犬源化抗體scFv-Fc的應(yīng)用，其特征在于：在制備預(yù)防或控制流感病毒的藥物或免疫制劑中的應(yīng)用。