[發明專利]可改善菌株以提升生產重組蛋白質的方法

在審

• 申請號: 202010105052.0
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN113278567A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 姜中人;陳立
• 申請（專利權）人: 杭州立丞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 郭雨桐

本發明提供一種可提升重組蛋白質表現的菌株，屬于大腸桿菌，所述的菌株是透過將glf基因、zwf基因、pgl基因、alaA基因及alaC基因整合至缺少ptsG基因、araABD基因操縱組、araFGH基因、及ppc基因操縱組的大腸桿菌菌株中。

技術領域

本發明是關于一種改善的大腸桿菌菌株以及利用所述大腸桿菌菌株提升生產重組蛋白質的方法，特別是關于一種以重建菌株的中心代謝途徑(central metabolism)改善的大腸桿菌菌株以及利用其生產重組蛋白質的方法。

背景技術

科技日新月異，現今的生物技術已經不可同日而語。牽涉到生物技術領域的東西時有耳聞，包括食品、化學品及醫療。目前生技產業利用各種生物平臺來發展高經濟價值的工業用酵素或醫療性蛋白質，如胰島素、紅血球生成素、乳酸及抗生素等。

植物、動物、昆蟲及微生物皆是目前常見蛋白生產的生物反應平臺。完整且優質的生物反應平臺必須具備的特性如下，低成本是必須的，且平臺容易操控，在多種環境條件皆可使用，并有效率的生產目標物。

大腸桿菌(Escherichia coli)因為具有培養容易、價格低廉、蛋白生產量大的特性而被作為目前表現外源蛋白最常用的系統之一，其中蛋白質的生成是通過DNA轉錄轉譯得到氨基酸鏈，再經過正確折疊及修飾才能成為具有特定功能的蛋白質，但這一段過程需要耗費大量的能量，所以如何獲取能量及獲得能量的效率將會對大腸桿菌生成特定蛋白質具有相當大的影響。

大腸桿菌如何獲取能量及獲得能量的效率會因為所攝取的成分例如碳源或氮源以及攝取后的成分通過和種代謝途徑而變化。

甘油又稱丙三醇(propanetriol)或甘醇(glycerine)，分子式為C3H8O3，物性是無色無臭有甜味的黏性液體，沸點為290℃，吸水性很強，在食品工業、藥品、個人護理用品、防凍劑、化學中間產品皆有應用。甘油的制備可由化學工業的方式及石化原料合成，但同時也是許多工業的副產品，例如制皂工業或是生質柴油。利用大腸桿菌來代謝甘油除了能消耗掉這些工業副產品，還能將之轉化為其它更高經濟價值的產物。例如琥珀酸、乳酸及1,2-丙二醇等。

甘油在大腸桿菌中的代謝路徑已被完整發表，甘油從細胞外進入細胞內是利用被動運輸的方式穿過細胞膜，通過甘油攝取促進蛋白(glpF)將甘油運輸至細胞膜內，glpF屬于輸水膜蛋白，輸送水及甘油，是一個高度選擇性的通道蛋白。當甘油進入細胞膜后，主要分為兩種不同的代謝路徑，分別為厭氧(glpF-gldA-dhaK),及好氧(glpF-glpK-glpD)路徑，將甘油轉化成二羥丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate；DHAP)。

厭氧路徑中，gldA基因(glycerol dehydrogenase；甘油脫氫酶)能將甘油轉換成DHA(dihydroxyacetone；二羥基丙酮)并生成NADH提供能量，再通過dhaK基因(dihydroxyacetone kinases；二羥基丙酮激酶)轉化成DHAP。

好氧路徑中，glpK基因(Glycerol kinase；甘油激酶)能將甘油磷酸化為G3P(glycerol-3-phosphate；甘油-3-磷酸)，但此過程需消耗ATP，再通過glpD基因(Aerobicglycerol-3-phosphate dehydrogenase；好氧甘油-3-磷酸脫氫酶)轉化成DHAP。