[發明專利]濕紙巾防腐效果的評價方法

有效

• 申請號: 202010100038.1
• 申請日: 2020-02-18
• 公開（公告）號: CN111206067B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 鐘俊鳥
• 申請（專利權）人: 威萊（廣州）日用品有限公司
• 主分類號: C12Q1/14
• 分類號: C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/04;C12R1/445;C12R1/19;C12R1/385
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥;徐翔

1.濕紙巾防腐效果的評價方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1布片染菌：分別將制備的各種細菌菌液等比例混合，制備的各種真菌懸液等比例混合，得混合菌液；

將10片尺寸為15cm×20cm的濕紙巾試樣分為細菌試樣5片，真菌試樣5片，試樣平展后，在四個角落以及中間分別滴染0.2mL混合菌液，使每片細菌試樣的細菌菌落數達2.5×10⁶cfu/片，使每片真菌試樣的真菌菌落數達1.5×10⁶cfu/片，滴染后分別放入無菌瓶，分別標記為細菌0d、細菌7d、細菌14d、細菌21d、細菌28d，真菌0d、真菌7d、真菌14d、真菌21d、真菌28d；

分別于0d、7d、14d、21d、28d加入100mL稀釋液作為洗脫液洗下濕紙巾試樣上的微生物，稀釋后取其中2個稀釋度的稀釋液1mL，置于滅菌平皿內，每個稀釋液接種兩個滅菌平皿，細菌用15mL涼至43℃的營養瓊脂培養基作傾注，真菌用15mL涼至43℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養基作傾注，轉動平皿，使充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平皿，細菌于35℃培養48h，真菌于28℃培養4d后，進行活菌菌落計數；

S2結果計算：M＝R×Z×100，式中，M為每個時間點細菌或真菌數量，R為稀釋倍數；Z為兩個平皿的菌落數的平均值，單位為cfu；100為洗脫液的用量，單位為mL；

S3評價方法：細菌總數從初始到14天的對數值減少值不能小于2.0，并且從14天到28天細菌數不能增加；真菌總數從初始到14天和28天不能增加，即說明濕紙巾具有防腐效果；

所述步驟S1中作為洗脫液的稀釋液為PBS稀釋液，PBS稀釋液的制備方法為：稱取無水磷酸氫二鈉2.83g、磷酸二氫鉀1.36g，加蒸餾水1000mL，待完全溶解后，調pH至7.2，經121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用；

所述細菌菌液包括金黃色葡萄球菌菌液、大腸桿菌菌液和銅綠假單胞菌菌液；

所述金黃色葡萄球菌菌液的制備方法為：

(1)取金黃色葡萄球菌凍干菌種管，凍干菌種管中凍干菌種的量為1.5×10⁷cfu/瓶，在無菌操作下打開，加入3mL營養肉湯培養基，輕柔吹吸，使菌種融化分散，得菌種懸液；取含8.0mL營養肉湯培養基的試管，滴入2mL菌種懸液，置37℃培養22h，用接種環取1代培養的菌懸液，劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，置37℃培養22h，挑取2代中典型菌落，接種于營養瓊脂斜面，于37℃培養22h，即為第3代培養物；

(2)取菌種第3代的營養瓊脂培養基斜面新鮮培養物，吸取4.0mL稀釋液加入斜面試管內，反復吹吸，洗下菌苔，將洗液移至另一無菌試管中，使細菌懸浮均勻，得原始菌懸液；

(3)先用細菌濃度比濁測定法測定步驟(2)所得原始菌懸液的含菌濃度，然后用稀釋液稀釋至3×10⁸cfu/mL，即得；

所述大腸桿菌菌液、銅綠假單胞菌菌液的制備方法與金黃色葡萄球菌菌液的制備方法類似；

所述稀釋液為PBS稀釋液，PBS稀釋液的制備方法為：稱取無水磷酸氫二鈉2.83g、磷酸二氫鉀1.36g，加蒸餾水1000mL，待完全溶解后，調pH至7.2，經121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用；

所述真菌懸液包括白假絲酵母菌懸液和黑曲霉孢子懸液；

所述白假絲酵母菌懸液的制備方法為：

(a)取白假絲酵母凍干菌種管，凍干菌種管中凍干菌種的量為1.2×10⁶cfu/瓶，以無菌操作打開，用毛細吸管吸加3mL沙堡液體培養基于管中，輕柔吹吸，使菌種融化分散，得菌種懸液；取含6.0mL沙堡液體培養基的試管，滴入菌種懸液，置37℃培養20h，用接種環取第1代培養物中典型菌落，劃線接種于沙堡瓊脂培養基平板上，于37℃培養20h，挑取第二代培養物中典型菌落，接種于沙堡瓊脂斜面，于37℃培養20h，即為第3代斜面培養物；

(b)試驗時，將步驟(a)所得第3代斜面培養物在沙堡瓊脂斜面上連續傳代，方法與第3代相同，取第5代的沙堡瓊脂培養基斜面新鮮培養物，吸取4.0mL稀釋液加入斜面試管內，反復吹吸，洗下菌苔，將洗液移至另一無菌試管中，使白假絲酵母菌懸液均勻，得原始菌懸液；

(c)先用細菌濃度比濁測定法測定步驟(b)所得原始菌懸液的含菌濃度，然后用稀釋液稀釋至4×10⁷cfu/mL，即得；

所述黑曲霉孢子懸液的制備方法為：

(Ⅰ)取黑曲霉凍干菌種管，凍干菌種管中凍干菌種的量為1.3×10⁶cfu/瓶，以無菌操作打開，用毛細吸管吸取3mL生理鹽水加到菌種管中，輕輕吹吸，使菌種沉淀物融化分散，得沉淀物懸液；取沉淀物懸液加到含5.0mL沙氏葡萄糖瓊脂培養基的試管中，置30℃培養45h，用接種環劃線接種第1代培養物于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板，置30℃培養箱中培養45h，取平板培養物中的典型菌落，接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面，置30℃培養箱中培養45h，即為第3代斜面培養物；

(Ⅱ)試驗時，取步驟(Ⅰ)所得第3代斜面培養物接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面，30℃培養8d，得黑曲霉分生孢子；

(Ⅲ)取6.0mL體積濃度為0.05％的吐溫80生理鹽水溶液，刮洗步驟(Ⅱ)所得黑曲霉分生孢子于溶液中，將孢子懸液移入無菌試管中，用已滅菌的脫脂棉濾過除去菌絲，濾過后，顯微鏡下觀察是否存在菌絲，若懸液中有菌絲存在，經5600r/min離心20min，再次在顯微鏡下觀察，若懸液中仍有菌絲存在，須再離心，直到無菌絲存在，使用時菌懸液的含菌量為2×10⁷cfu/mL；

所述稀釋液為PBS稀釋液，PBS稀釋液的制備方法為：稱取無水磷酸氫二鈉2.83g、磷酸二氫鉀1.36g，加蒸餾水1000mL，待完全溶解后，調pH至7.2，經121℃壓力蒸汽滅菌20min后備用。